Ocena interakcji między bakteriami a komórkami gospodarza za pomocą kulek biomimetycznych

Streszczenie

Źródło: Stones, D. H., et al. Materiały biomimetyczne do charakteryzowania interakcji bakteria-gospodarz. J. Vis. Exp. (2015)

Ten film pokazuje zastosowanie kulek bakteriomimetycznych do ilościowego określenia adhezji bakterii do komórek nabłonka gospodarza w konkurencyjnych warunkach. Przedstawiono w nim etapy związane z traktowaniem komórek, ich lizą i posiewaniem seryjnych rozcieńczeń w celu pomiaru jednostek tworzących kolonie.

Protokół

1. Pomiar adhezji bakteryjnej
   1. We wskazanych punktach czasowych (np. 1 godzinę po zakażeniu) usuń pożywkę z warstwy komórkowej.
   2. Dokładnie umyj warstwę komórkową sterylnym, wstępnie podgrzanym roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS) (co najmniej 3-4 płukania po 1 ml PBS każde), aby usunąć wszelkie nieprzyłączone komórki.
   3. Lizować komórki gospodarza przez dodanie 1 ml sterylnego 1% v/v roztworu Triton X-100 do PBS na studzienkę. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 5 minut.
   4. Odpipetować każdą próbkę w górę i w dół kilka razy przed przeniesieniem zawartości każdej studzienki do oddzielnych probówek o pojemności 1,5 ml. Przygotować 10-krotne seryjne rozcieńczenia próbek do sterylnego PBS (np. użyć 100 ml próbki i 900 ml PBS).
   5. Umieścić 100 μl każdej próbki na morskim agarze Luria-Bertani (MLB) i rozprowadzić za pomocą rozsiewacza komórek. Zoptymalizuj rozcieńczenia do płytki w zależności od szczepów bakteryjnych i punktu czasowego.
      Uwaga: Dla opisanego układu doświadczalnego, 10⁵ lub 10^6-krotne rozcieńczenia dają odpowiednią liczbę jednostek tworzących kolonie (CFU).
   6. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C O/N i policzyć bakterie przez zliczanie kolonii.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Odczynniki
Koraliki z polistyrenu modyfikowanego karboksylanem	Sigma	CLB9	szkodliwe; dostępny
jest szereg alternatywnych rozmiarów cząstek i kolorówDulbecco's Modified Eagle's Medium - wysoka zawartość glukozy - Z 4500 mg/L glukozy i wodorowęglanem sodu, bez L-glutaminy, pirogronianu sodu i czerwieni fenolowej, płynny, sterylnie filtrowany, odpowiedni do hodowli komórkowych	Sigma	D1145	do eksperymentów z infekcjami
DMEM	Sigma	D6429	do utrzymania hodowanych komórek gospodarza
Płodowa surowica bydlęca, inaktywowana termicznie	Sigma	F9665	suplement do pożywki do hodowli tkankowych
Penicylina-Streptomycyna -Stabilizowany roztworem, z 10 000 jednostek penicyliny i 10 mg streptomycyny/ml, sterylnie filtrowany, BioReagent, odpowiedni do hodowli komórkowych	Sigma	F9665	suplement do pożywki do hodowli tkankowych
PBS	Sigma	D8537
Plastikowe
płytki 24-dołkowe	Greiner	662160
Sprzęt
Urządzenia do
Pipeta

hodowli tkankowychwielokanałowa