Oddzielanie bakterii według ilości kapsułek za pomocą nieciągłego gradientu gęstości

Streszczenie

Źródło: Feltwell, T., et.al. Oddzielanie bakterii według ilości kapsułki za pomocą nieciągłego gradientu gęstości. J. Vis. Exp. (2019 rok)

Ten film pokazuje zastosowanie nieciągłego gradientu gęstości do oddzielania szczepów bakteryjnych na podstawie ilości kapsułek. Poprzez odwirowanie biblioteki mutantów transpozonów przez gradient, bakterie o różnej gęstości kapsułek lokalizują się w różnych warstwach. Oddzielone frakcje można następnie zebrać do dalszej analizy.

Protokół

1. Dodawanie przygotowanych komórek do gradientów i rozdzielanie przez odwirowanie

1. Dodaj 600 μl przygotowanych komórek na wierzch gradientu w probówce bardzo powoli i bez mieszania interfejsu.
2. Umieść probówki w adapterach rur i zważ połączone łączniki i rurki, aby upewnić się, że są wyważone.
   1. Umieść adaptery probówek w wirniku o stałym kącie nachylenia w wirówce stołowej. Wirować przez 30 minut przy 3 000 x g.
   2. Po odwirowaniu ostrożnie wyjmij probówki, umieść je w odpowiednim stojaku i sfotografuj wyniki jako zapis.
3. Odzyskaj frakcje bakteryjne do ilościowego oznaczania kwasu uronowego lub ekstrakcji DNA.
   1. Jeśli dalsze zastosowania nie są wymagane, pozbądź się próbek/gradientów odpowiednią drogą płynnych odpadów biologicznych w laboratorium.
      UWAGA: Ważne jest, aby sprawdzić sposób separacji dla nowych gatunków/szczepów bakterii. Poszczególne frakcje z gradientu należy zbadać pod mikroskopem, za pomocą testu kwasu uronowego lub innego odpowiedniego testu ilościowego w celu potwierdzenia fenotypu kapsułki każdej frakcji. Jeżeli celem jest rozdzielenie na podstawie agregacji lub wielkości komórek, należy zastosować niezależne odpowiednie testy.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Percoll	GE Healthcare	17-0891-01
Wirówka 5810R z wirnikiem A-4-81 i wiadrami 500ml	Eppendorf	5810 718.007
Adaptery do probówek 15 ml	Eppendorf	5810 722.004
Rotor o stałym kącie F-34-6-38	Eppendorf	5804 727.002
Adapter probówki 2,6 - 7 ml	Eppendorf	5804 739.000
Wirówka 5424 z wirnikiem FA-45-24-11	Eppendorf	5424 000.460
5 ml polipropylenowa rurka z okrągłym dnem	Falcon	352063