$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Chromatografia wykluczająca według wielkości (SEC)
NUTA: SEC stosuje się w celu zwiększenia czystości pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) i usunięcia białka niepęcherzykowego.
- Użyj małej kolumny SEC (objętość złoża 10 ml) do izolacji EV od <100 ml materiału wyjściowego i większej kolumny (objętość złoża 47 ml) do izolacji EV od >100 ml materiału wyjściowego.
NUTA: W poniższym przykładzie zostaną wyświetlone woluminy dla większej kolumny, z woluminami dla mniejszej kolumny w nawiasach. - Doprowadź kolumnę SEC i sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) do temperatury pokojowej przez kilka godzin. Ustabilizuj kolumnę SEC w pozycji pionowej za pomocą standardowego stojaka laboratoryjnego i uchwytu. Alternatywnie można użyć komercyjnych stojaków na kolumny chromatograficzne.
- Przed podłączeniem do kolumny SEC należy uwodnić zbiornik próbki, pozwalając 5 ml PBS przepłynąć przez frytę do pojemnika na odpady. Odkręć nakrętkę wlotową kolumny SEC, dodaj 2 ml PBS do zbiornika próbki i ostrożnie podłącz zbiornik do kolumny, gdy PBS kapie przez frytę (nie dotyczy małych kolumn SEC). NUTA: Ten poprzedni krok zapobiega uwięzieniu pęcherzyków powietrza w górnej części kolumny SEC. Jeśli powietrze jest uwięzione, wyjmij zbiornik, postukaj w kolumnę, aby usunąć pęcherzyk powietrza i powtórz procedurę podłączania. W przypadku mniejszej kolumny wystarczy odkręcić górną część kolumny SEC i przymocować zbiornik na próbkę.
- Dodać 47 ml (10 ml) PBS do zbiornika próbki i odkręcić dno kolumny SEC. Pozwolić, aby cały załadowany bufor próbki przepłynął przez kolumnę w celu zrównoważenia. Odrzuć przepływ.
- Załadować maksymalnie 2 ml (0,5 ml) próbki do zbiornika próbki, odrzucić przepływ i pozwolić, aby próbka całkowicie weszła do kolumny.
- Natychmiast dodać PBS do zbiornika na próbkę lub leja o objętości 14,25 ml minus objętość próbki (3 ml minus objętość próbki dla małej kolumny). Pozwól, aby roztwór przepłynął przez kolumnę i odrzuć tę ilość równą objętości pustej kolumny.
NUTA: W przypadku typowej próbki o pojemności 2 ml ilość PBS, którą należy dodać do zbiornika na próbkę lub leja samowyładowczego, wyniesie 12,25 ml. - Umieść mikroprobówkę o niskim poziomie wiązania o pojemności 2 ml bezpośrednio pod kolumną SEC. Natychmiast dodać 2 ml (0,5 ml) PBS do zbiornika próbki i pozwolić mu wejść do kolumny. Oznacz pierwsze 2 ml (0,5 ml) przepływu jako frakcję 1. Kontynuuj dodawanie 2 ml (0,5 ml) na raz do zbiornika próbki, aby zebrać każdą kolejną frakcję.
NUTA: Większość bakteryjnych EV wymywa się w pierwszych 5 frakcjach. Podczas optymalizacji zebrano pierwsze 12 frakcji. - Frakcje należy przechowywać w temperaturze 4 °C w przypadku krótkotrwałego przechowywania (dni) lub -80 °C w przypadku długotrwałego przechowywania.