Kwantyfikacja amyloidów wywołanych infekcjami bakteryjnymi za pomocą fluorescencji tioflawiny T

Streszczenie

Źródło: Balczon, R., et al. Metody wykrywania cytotoksycznych amyloidów po zakażeniu komórek śródbłonka płuc przez Pseudomonas aeruginosa. J. Vis. Exp. (2018)

Ten film przedstawia protokół ilościowego oznaczania amyloidów w supernatantach z hodowli komórek śródbłonka płuc zakażonych zjadliwymi bakteriami, przy użyciu tioflawiny T, barwnika fluorescencyjnego, który wiąże się ze strukturami beta-arkuszy amyloidu. Wzrost fluorescencji w porównaniu z wartością wyjściową wskazuje na obecność amyloidów w supernatancie hodowli.

Protokół

1. Analiza supernatantów cytotoksycznych

1. Aby wykonać test tioflawiny T (ThT), użyj fluorescencji ThT do ilościowego określenia amyloidów w supernatantach. Do tych pomiarów należy używać supernatantów sterylizowanych filtrem.
   1. Przygotować roztwór podstawowy (50x) ThT, zawieszając 8 mg ThT w 10 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Po wymieszaniu przefiltruj roztwór przez filtr 0,22 μm w celu usunięcia cząstek stałych.
   2. W przypadku pomiarów dodaj 20 μl materiału ThT do 1 ml PBS w kuwecie spektrofotometru o pojemności 1 ml. Umieścić rozcieńczoną próbkę w spektrofluorometrze.
   3. Zmierzyć podstawową emisję fluorescencji za pomocą wzbudzenia 425 nm i skanować emisję fluorescencji w zakresie 450-575 nm w krokach co 2 nm.
   4. Wykonaj skan poklatkowy przy użyciu wzbudzenia 425 nm i emisji 482 nm, z danymi zbieranymi co 0,2 s przez 60 s.
   5. Początkowe 20 s skanu poklatkowego mierzy fluorescencję w ślepej kuwecie. Po 20 s przerwij skanowanie i dodaj 10 μl supernatantu wysterylizowanego przez filtr do kuwety. Wymieszaj kuwetę przez odwrócenie, a następnie umieść ją z powrotem w spektrofluorometrze.
   6. Wznów skanowanie na podstawie czasu, uzyskując ostatnie 40 s danych.
   7. Po zakończeniu skanowania poklatkowego wykonaj końcowe skanowanie widma emisji fluorescencji przy użyciu identycznych ustawień, jak opisano w kroku 1.3.

Materiały