Otrzymywanie cytotoksycznych amyloidów po zakażeniu bakteryjnym komórek śródbłonka płuc szczura

W tym artykule

Streszczenie

Źródło: Balczon, R., et al. Metody wykrywania cytotoksycznych amyloidów po zakażeniu komórek śródbłonka płuc przez Pseudomonas aeruginosa. J. Vis. Exp. (2018)

Ten film przedstawia procedurę wytwarzania cytotoksycznego supernatantu z komórek śródbłonka płuc po zakażeniu Pseudomonas aeruginosa. Opisuje, w jaki sposób bakteryjne białka efektorowe zaburzają strukturę komórek gospodarza i indukują uwalnianie cytotoksycznych oligomerów amyloidowych do supernatantu.

Protokół

Wytwarzanie supernatantów cytotoksycznych:

Pierwotne hodowle komórek mikronaczyniowego śródbłonka płuc szczurów (PMVEC) uzyskano z Cell Culture Core Facility w Centrum Biologii Płuc Uniwersytetu Południowej Alabamy.

W celu wytworzenia cytotoksycznych supernatantów, umieść 2 x 10⁶ komórek na pojedynczych szalkach o długości 150 cm i hoduj przez 3 - 4 dni, aż do osiągnięcia konfluencji. Użyj dwóch płytek na eksperyment.
Aby wytworzyć supernatant, umyj jedną z dwóch 150 cm naczyń PMVEC solą fizjologiczną buforowaną fosforanami, spróbuj spodziać, a następnie policz komórki. Umyj drugie naczynie PMVEC zrównoważonym roztworem soli Hanka (HBSS), a następnie zainfekuj dowolnym szczepem Pseudomonas aeruginosa przy wielokrotności infekcji (MOI) 20:1. Osiąga się to w następujący sposób:
1. Dla P. aeruginosa, OD₅₄₀ 0,25 = 2 x 10⁸ jtk/ml. Aby przygotować to rozcieńczenie, dodaj 1 ml HBSS do jednorazowej kuwety o pojemności 1 ml. Zeskrob wystarczającą ilość bakterii z płytki, aż do osiągnięcia OD₅₄₀ 0,25 podczas pomiaru za pomocą spektrofotometru. Następnym krokiem będzie obliczenie, ile bakterii będzie potrzebnych.
2. Po ustaleniu liczby PMVEC w szalce hodowlanej należy określić odpowiednią liczbę bakterii, które należy dodać do drugiej, nietrypsynizowanej szalki hodowlanej zawierającej PMVEC. Na przykład, jeśli ustalono, że naczynie hodowlane PMVEC zawiera 1,3 x 10⁷ komórek, należy przygotować 1,3 x 10⁷ komórek x 20 bakterii/komórkę x 1 ml / 2 x 10⁸ CFU = 1,3 ml bakterii.
3. Rozcieńczyć 1,3 ml bakterii w HBSS do końcowej objętości 20 ml, tak aby cała powierzchnia naczynia o długości 150 cm mogła być pokryta płynem, a następnie dodać rozcieńczone bakterie do płytki PMVEC.
4. Inkubować PMVEC zaszczepione bakteriami w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5% CO₂przez 4 - 5 godzin, aż będzie można zobaczyć przerwy tworzące się w monowarstwie komórki, gdy płytka jest obserwowana pod mikroskopem (patrz rysunek 1 w celu uzyskania prawidłowego poziomu tworzenia luki).
5. Zebrać supernatant, a następnie odwirować przez 10 minut przy 2,000 x g w wirówce stołowej w celu usunięcia resztek komórkowych.
  Nuta: Na tym etapie można użyć dowolnej wirówki stołowej zdolnej do wytworzenia siły g wystarczającej do osadzania niezlizanych komórek i dużych fragmentów komórek.
6. Wlej supernatant do strzykawki z filtrem 0,2 μm przymocowanym do jej końca, a następnie przepuść supernatant przez filtr w celu usunięcia bakterii.
7. Użyć podwielokrotności sterylnego supernatantu do zbadania cytotoksyczności i zamrozić resztę supernatantu w temperaturze -80 °C do wykorzystania w przyszłości.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Rysunek 1. Wpływ inokulacji P. aeruginosa na morfologię PMVEC. Zlewająca się monowarstwa PMVEC przed (A) i cztery godziny po dodaniu (B) szczepu PA103 P. aeruginosa. Luki są wyraźnie widoczne w monowarstwie komórek w zainfekowanyc...