Zachowanie rojowe Pseudomonas aeruginosa pod wpływem stresu antybiotykowego

Streszczenie

Źródło: Bru, J., et al., Obrazowanie poklatkowe rojów bakteryjnych i zbiorowa reakcja na stres. J. Vis. Exp. (2020)

Ten film przedstawia procedurę analizy zachowania roju Pseudomonas aeruginosa poprzez obserwację wzrostu bakterii z centralnej hodowli w kierunku plam satelitarnych zawierających tę samą kulturę zmieszaną z antybiotykiem, przy użyciu zestawu płytki agarowej i obrazowania poklatkowego.

Protokół

1. Wzrost P. aeruginosa i warunki posiewu

1. Przygotuj 400 ml bulionu lizogenicznego (LB), dodając 10 g mieszanki proszku LB-Miller do 400 ml ddH₂O. Dodaj dodatkowe 8 g agaru na 2% LB-agarowe szalki Petriego. Autoklaw do sterylizacji.
2. Wlej 20 ml stopionej pożywki LB-agarowej do szalek Petriego o średnicy 10 cm i pozwól im zestalić się w temperaturze pokojowej przez noc. Przechowywać płynne podłoże w temperaturze pokojowej, a płytki agarowe w temperaturze 4 °C.
3. Smugi P. aeruginosa na szalce Petriego LB-agar z zamrożonego bulionu przechowywanego w temperaturze -80 °C za pomocą sterylnych pętelek lub drewnianych patyczków. Inkubować szalkę Petriego do góry nogami przez noc w temperaturze 37 °C. Przechowywać płytkę LB-agar w temperaturze 4 °C przez okres do 1 tygodnia.
4. Wybrać pojedynczą kolonię z szalki Petriego za pomocą sterylnej pętli lub drewnianego patyczka, zaszczepić ją w pożywce o pojemności 2 ml LB i inkubować kulturę do nasycenia przez noc (16–18 godzin) w temperaturze 37 °C w bębnie rolkowym ustawionym na 100 obr./min.
5. Odmierzyć pipetę 5 μl nocnej hodowli z kroku 1.4 za pomocą pipety P20 i umieścić na środku płytki agarowej roju, zbliżając się do końcówki pipety pod kątem (10–45°) 2,5 cm powyżej obszaru plamienia, pipetując w dół do pierwszego przystanku i dotykając agaru tylko kroplą płynu (Rysunek 1B).
   1. Unikaj dotykania agaru końcówką pipety, ponieważ może to spowodować uszkodzenie agaru. Użyj szablonu, aby ustawić miejsce spójnie na różnych płytkach agarowych roju.
6. W przypadku antybiotykoterapii należy zmieszać 30 μl hodowli P. aeruginosa na noc z kroku 1.4 z 6 μl 3 mg/ml gentamycyny, 10 μl 100 mg/ml kanamycyny lub 7,5 μl 100 mg/ml fosfomycyny. Przejdź od razu do następnego kroku.
   1. Odpipetować 6 μl P. aeruginosa poddanego działaniu antybiotyku za pomocą pipety P20 i umieścić w 6 równoodległych pozycjach satelitarnych na koncentrycznym okręgu o promieniu 2,8 cm wokół środka szalki, zbliżając się do końcówki pipety pod kątem (10 do 45°) 2,5 cm powyżej obszaru plamkowania, pipetując do pierwszego przystanku, i dotykając agaru tylko kroplą płynu (rysunek 1D).
   2. Unikaj dotykania agaru końcówką pipety, ponieważ może to spowodować jego uszkodzenie. Użyj szablonu do powlekania, aby uzyskać spójność.
7. Zastąp przezroczyste pokrywki szalki Petriego czarnymi pokrywkami (Rysunek 2A).
8. Umieść rojące się płytki agarowe na skanerze w inkubatorze ustawionym na 37 °C z 10 l łaźni wodnej, aby utrzymać wilgotność 75% (Rysunek 1E, Rysunek 2B). OSTROŻNOŚĆ: Nie przeszkadzaj plamistym komórkom na rojących się płytkach agarowych. Talerze powinny być zawsze skierowane do góry.

Wyniki

Rycina 1: Schemat testu roju P. aeruginosa i zbiorowej reakcji na stres. (A) Komórki P. aeruginosa są hodowane przez noc (16–18 godzin do OD₆₀₀ około 1,5) w bulioni...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Odczynniki
Agar baktowy, odwodniony	BD Difco	214010	Do płytki LB-agar i płytki agarowej do roju
Kasaminokwasy	BD Difco	223050	Do roju mediów
D-glukoza	Fisher Chemiczny	Zobacz materiał D16500	Dekstroza. Do roju mediów
Sól disodowa fosfomycyny	Przemysł chemiczny w Tokio	F0889 powiedział:	Stężenie magazynowe: 200 mg / ml. Rozpuszczony w ddH₂O
Siarczan gentamycyny	Sigma-Aldrich	G1914 powiedział:	Stężenie zapasowe: 3 mg / ml. Rozpuszczony w ddH₂O
Siarczan kanamycyny	Sigma-Aldrich	60615	Stężenie magazynowe: 100 mg / ml. Rozpuszczony w ddH₂O
LB-Młynarz	BD Difco	244620	Do bulionu LB i płytek agarowych LB
Siarczan magnezu siedmiowodny	Sigma-Aldrich	230391	Do roju mediów
Szczepów
Pseudomonas aeruginosa	Laboratorium Siryaporn	AFS27E.118	Szczep PA14
Dostaw
Papier ścierny z tlenku glinu	3 mln	150 Grzywna	Do czarnych pokryw
tkanina	Joann	PRD7089	tkanina
farba w sprayu	Krylon	5592 matowy	Do czarnych pokryw
Kolba Erlenmeyera	Kimax (Kimax)	26500	250 ml
Szklane butelki do przechowywania	Pyrex	13951L	250 ml, 500 ml, 1000 ml
8-calowe opaski zaciskowe	Giętarka Gardnera	E173770	Do mocowania czarnej matowej tkaniny
Szalki Petriego (100 mm x 15 mm)	Rybak	FB0875712	Płyty styropianowe 100 x 15 mm
Drewniane patyczki	Rybak	23-400-102	Do smug i zaszczepiania bakterii
Sprzęt
Autoklaw	Rynek Kuźnia Przemysłowa	Jednostka STM-E	Do sterylizacji odczynników
Pipeta 25 ml	Stany Zjednoczone Naukowe, Inc.	1072-5410	Do pipetowania 20 ml do rojenia płytek agarowych
Osuszacz	Frigidaire	FAD704DWD 70 litrów	Do utrzymania wilgotności względnej w pomieszczeniu na poziomie około 45%
Inkubator	Firma VWR	89032-092	Do rozwoju bakterii w temperaturze 37 °C
Kąpiel wodna Isotemp	Rybak	15-462-21Q	Do chłodzenia mediów do 55 °C
Okap z przepływem laminarnym	Firma Baker	SG603A	Do suszenia talerzy
Pibuła P-20	Gilson	F123601	Plamienie na rojących się płytkach agarowych
Kontroler pipet	Marka Tech	Dysza akumulatorowa	Do pipetowania 20 ml do rojenia płytek agarowych