Test Coincubation do badania konkurencyjnych interakcji między szczepami bakterii

Streszczenie

Źródło: Speare, L., et al. Test komonetacyjności do ilościowego określania konkurencyjnych interakcji między izolatami Vibrio fischeri. J. Vis. Exp. (2019 rok)

Ten film przedstawia test współinkubacji używany do badania, w jaki sposób szczepy bakteryjne konkurują ze sobą we wspólnym środowisku. Jest szeroko stosowany w mikrobiologii do identyfikacji mechanizmów, takich jak zabijanie zależne od kontaktu lub niezależne od kontaktu, które napędzają te interakcje.

Protokół

1. Równoczesne szczepy (ryc. 1B, C)
   1. Wymieszaj szczep referencyjny i szczep konkurencyjny w stosunku 1:1 (v/v), dodając 100 μl każdego szczepu (znormalizowanego do OD 1,0) do znakowanej 1,5 ml probówki wirówkowej. Jako kontrolę, zmieszaj odkształcenie odniesienia z różnie oznaczoną wersją samego siebie (szczep referencyjny pVSV102 + szczep referencyjny pVSV208). Ta kontrola jest wymagana do późniejszej analizy statystycznej w celu określenia, czy obecność szczepu konkurencyjnego wpływa na wzrost szczepu referencyjnego. Wiruj kulturę mieszanego szczepu przez 1-2 s.
      NUTA: Ten krok może wymagać optymalizacji, ponieważ współczynnik początkowy może znacząco wpłynąć na wyniki i może wymagać dostosowania.
   2. Powtórzyć krok 1 dla każdej kontrpróby biologicznej. Po wykonaniu tego etapu powinno być w sumie osiem probówek ze szczepami mieszanymi: cztery kontrpróby biologiczne z różnie znakowanymi szczepami referencyjnymi (kontrola) i cztery kontrpróby biologiczne z różnie znakowanymi szczepami referencyjnymi i konkurencyjnymi (eksperymentalne).
   3. Umieścić 10 μl każdej mieszaniny kontrolnej i doświadczalnej na płytkach Petriego zawierających agar LBS; Te plamki hodowlane zostaną wykorzystane do mikroskopii fluorescencyjnej po inkubacji.
   4. Pozostawić plamki do całkowitego wyschnięcia na stole do momentu, gdy cały płyn zostanie wchłonięty przez agar i inkubować płytki Petriego w temperaturze 24 °C przez 24 godziny. Szczepy V. fischeri oznaczone pVSV102 i pVSV208 potrzebują co najmniej 15 godzin, aby osiągnąć wystarczająco wysoką gęstość komórek, aby uwidocznić odpowiednio białko zielonej fluorescencji (GFP) i białko czerwonej fluorescencji (RFP) na poziomie populacji za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. W tym przypadku stosujemy 24-godzinną inkubację do obrazowania mieszanych miejsc.
      NUTA: Ważne jest, aby używać talerzy, które nie są zbyt wilgotne ani zbyt suche. Jeśli płytki są zbyt wilgotne, plamki coincubation nie zostaną wchłonięte przez płytkę agarową; Unikaj używania talerzy wylanych tego samego dnia. Jeśli płytki są zbyt suche, na powierzchni agaru mogą tworzyć się małe fale lub pęknięcia, co sprawia, że plamki coincubation mają nieregularny kształt.

Wyniki

Rysunek 1: Schemat blokowy ilustrujący test coincubacji. (A) Szczepy bakteryjne zawierające pVSV102 (szczep referencyjny oznaczony jako Ref. Strain lub R.S.) lub pVSV208 (szczep konkurencyjny oznaczony jako Comp. Strain lub C.S.) są...

Materiały