Przygotowanie bioluminescencyjnej enterokrwotocznej inokulacji Escherichia coli

Streszczenie

Źródło: Kuo, C., et al. Wykrywanie enterokrwotocznej kolonizacji Escherichia coli u mysiego gospodarza za pomocą nieinwazyjnego systemu bioluminescencji in vivo . J. Vis. Exp. (2018)

Ten film demonstruje przygotowanie enterokrwotocznej zawiesiny Escherichia coli z ekspresją lucyferazy z zamrożonego bulionu do stosowania jako inokulum doustne w modelach zwierzęcych. Umożliwia to bioluminescencyjne śledzenie kolonizacji jelit w czasie rzeczywistym podczas badań infekcji in vivo.

Protokół

1. Bioluminescencyjny preparat bakterii EHEC (enterokrwotoczny Escherichia coli) do inokulacji doustnej

NUTA: Schemat blokowy osi czasu procedur eksperymentalnych dotyczących preparatu EHEC i zgłębnika jamy ustnej myszy przedstawiono na rysunku 1 , aby pomóc w przygotowaniu eksperymentalnym.

1. Smuga bakterii E. coli O157:H7 EDL933 przenoszących plazmid lucyferazy na płytce agarowej LB (Luria-Bertani) z 50 μg/ml kanamycyny z bulionu -80 °C. Hoduj bakterie przez 16 - 18 godzin w temperaturze 37 °C.
2. Pobrać pojedynczą kolonię z płytki na noc i hodować w 3 ml pożywki LB z 50 μg/ml kanamycyny przez 16 - 18 godzin w inkubatorze o temperaturze 37 °C przy 220 obr./min.
3. Subhodowla bakterii (rozcieńczenie 1:100) do bulionu LB zawierającego kanamycynę (50 μg/ml) przez 2,5 - 3 godziny w inkubatorze o temperaturze 37 °C przy 200 obr./min. (Na przykład dodaj 2 ml bakterii hodowanych przez noc do 200 ml pożywki LB z uzupełnioną kanamycyną (50 μg / ml))
4. Inkubować bakterie przez 2,5 - 3 godziny i mierzyć wartość gęstości optycznej (OD) przy 600 nm (OD₆₀₀), aż wartość będzie mieścić się w przedziale od 0,9 do 1. Liczba komórek bakteryjnych ma gęstość około 10⁸ jednostek tworzących kolonie (CFU)/ml.
5. Odwirować ponownie wyhodowane bakterie w temperaturze 8 000 x g przez 30 minut, w temperaturze 4 °C.
6. Wyrzucić supernatant bez mieszania osadu bakteryjnego i przemyć go 100 ml 0,9% sterylnego roztworu soli fizjologicznej przez delikatne mieszanie.
7. Powtórz kroki 1.5 i 1.6 raz.
8. Po przemyciu odwirować kulturę bakteryjną o sile 8 000 x g przez 30 minut, w temperaturze 4 °C i delikatnie wyrzucić supernatant.
9. Skondensować granulkę 100-krotnie z 0,9% sterylną solą fizjologiczną. Na przykład, jeśli odwiruje się 200 ml bakterii, dodaj 2 ml zwykłej soli fizjologicznej, aby zawiesić osad.
10. Potwierdzić obecność bakterii CFU (powinna wynosić około 10-9 jtk/100 μl po kondensacji w roztworze soli fizjologicznej) poprzez posiew skoncentrowanych bakterii przez 10-krotne seryjne rozcieńczenie.

Wyniki

Rysunek 1: Oś czasu schematu blokowego przygotowania eksperymentalnego.

Przegląd czasu potrzebnego do przygotowania bioluminescencyjnych bakterii EHEC i wstępnego leczenia myszy streptomycyną. A) Przygotowanie EHEC. (B) Preparat na myszy.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Inkubator z wytrząsarką	JIH DER	LM-570R	inkubacja bakterii
Inkubator z wytrząsaniem orbitalnym	PO PIERWSZE	Silnik S300	inkubacja bakterii
Glicerol	SIGMA	G5516-1L	Służy do roztworu do przechowywania bakterii
Chlorek sodu	Sigma	31434-5KG-R	substancja chemiczna do wytwarzania podłoża LB, 10 g/L
Trypton	CONDA pronadisa	Nr kat. 1612.00	substancja chemiczna do wytwarzania podłoża LB, 10 g/L
Ekstrakt drożdżowy w proszku	Affymetrix	23547-1 KG	substancja chemiczna do wytwarzania podłoża LB, 5 g/L
Agar	CONDA pronadisa	Nr kat. 1802.00	substancja chemiczna do produkcji agaru LB
Kanamycyna	Sigma	Sieć K4000-5G	antybiotyki, stosowanie do selecitonu
Streptomycyny	Sigma	S6501-100G	antybiotyki, eliminują mikrobiotę u myszy
Wirówka szybkoobrotowa	Beckman Coulter	Avanti, J-26S XP	Służy do odwirowywania bakterii
Wirnik o stałym kącie nachylenia	Beckman Coulter	JA25.5	Służy do odwirowywania bakterii
Wirnik o stałym kącie nachylenia	Beckman Coulter	JLA10.5	Służy do odwirowywania bakterii
Butelki wirówkowe	Beckman Coulter	REF357003	Służy do odwirowywania bakterii
Butelki wirówkowe	Thermo Fisher naukowy	3141-0500	Służy do odwirowywania bakterii
Biofotometr Eppendorf plus	Eppendorf powiedział:	AG 22331 Hamburg	do pomiaru wartości OD600 bakterii