Hodowla bakterii beztlenowych redukujących siarczyny z kultury agarowej

Streszczenie

Źródło: Anwar, Z., et al. Wzbogacanie i wykrywanie toksyn Clostridium perfringens w detalicznych próbkach żywności. J. Vis. Exp. (2019).

W tym filmie bakterie redukujące siarczyny są hodowane w pożywce agarowej zawierającej siarczyny, gdzie rosną beztlenowo i redukują siarczyn do siarkowodoru, tworząc czarne osady z jonami żelaza. Czarne kolonie są izolowane z głębokości agaru przy użyciu technik aseptycznych i przenoszone do świeżej pożywki w celu kontynuacji inkubacji beztlenowej.

Protokół

UWAGA: Clostridium perfringens jest uważany za organizm o poziomie zagrożenia bezpieczeństwa biologicznego 2 (BSL2). Chociaż nie wszystkie próbki żywności będą zawierały C. perfringens, wszystkie próbki hodowlane powinny być traktowane jako takie. Przez cały czas należy nosić wszystkie odpowiednie środki ostrożności i środki ochrony osobistej (PPE). Odkaż cały materiał przed utylizacją.

1. Przygotuj zmodyfikowany RPM (Rapid perfringens medium)

1. Połączyć 30 g/l płynnego tioglikolanu, 60 g/l żelatyny, 5 g/l peptonu, 5 g/l glukozy, 5 g/l dwuzasadowego fosforanu potasu, 3 g/l ekstraktu drożdżowego, 1,5 g/l chlorku sodu, 0,5 g/l siarczanu żelazawego w wodzie dejonizowanej, aż do równomiernego rozproszenia. Zazwyczaj wykonujemy partie o pojemności 1 litra.
2. Autoklaw w temperaturze 121 °C przez 15 min.
3. Pozostawić do ostygnięcia do temperatury około 40 °C.
4. Gdy RPM ostygnie, dodaj D-cykloserynę do końcowego stężenia 440 mg/l.
   NUTA: Podstawowe stężenia D-cykloseryny rozpuszczone w sterylnej wodzie o stężeniu 50 mg/ml mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C do wykorzystania w przyszłości.
5. Przenieść aseptycznie 10 ml prędkości obrotowej na minutę do stożkowych probówek o pojemności 15 ml. RPM można przygotowywać partiami i przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do jednego miesiąca.
6. Przed użyciem rozgrzać obroty do 37 °C.

2. Pobieranie próbek i inkubacja RPM

1. Żywność należy transportować do laboratorium w temperaturze otoczenia w ciągu 1 godziny. Żywność może być transportowana w oryginalnych opakowaniach lub sterylnych pojemnikach. Jeśli żywność nie zostanie natychmiast przetestowana, może być przechowywana w temperaturze -20 °C do czasu użycia. Jeśli to możliwe, zanotuj rodzaj żywności i kraj pochodzenia zgodnie z etykietą na opakowaniu, a także wszelkie inne istotne informacje.
2. Usuń około 1,0–2,0 g pokarmu i przenieś na sterylną szalkę Petriego lub równoważną. Drobno zmielić sterylną żyletką lub skalpelem.
3. Zaszczepić w 10 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) w stożkowej probówce o pojemności 15 ml. Dobrze wymieszaj.
   1. Aby wybrać komórki wegetatywne, przenieś 5 ml mieszaniny PBS i żywności do stożkowej probówki o pojemności 15 ml zawierającej 10 ml RPM. Szczelnie dokręć pokrywę.
   2. Aby wybrać zarodniki, podgrzej pozostałe 5 ml mieszaniny PBS i żywności w temperaturze 85 °C przez 15 minut, a następnie przenieś do stożkowej probówki o pojemności 15 ml zawierającej 10 ml obr./min. Szczelnie dokręć pokrywę.
4. Wiruj i odwróć kultury żywności-RPM, aby zapewnić całkowite wymieszanie.
5. Szczelnie zamknij stożkowe rurki i owiń pokrywki folią parafinową lub folią plastikową, aby zapewnić środowisko beztlenowe.
6. Inkubować przez noc (ON) w temperaturze 37 °C.
7. Następnego ranka zwróć uwagę na zmętnienie lub fermentację w rurkach RPM.

3. TSC (cykloseryna siarczynu tryptozy) "kanapkowa" powłoka

1. Zaszczepić kultury ON RPM w agarze TSC przy użyciu techniki "kanapkowej" (ryc. 1) opisanej poniżej.
2. Przygotuj agar TSC zgodnie z instrukcjami producenta.
   1. Przygotować warstwę bazową płytek TSC, przenosząc 10 ml stopionego agaru TSC na sterylne szalki Petriego i pozostawić do zestalenia. Można je przygotować w stanie zaawansowanym i przechowywać w temperaturze 4 °C. Przed użyciem należy upewnić się, że talerze są ogrzane do temperatury pokojowej.
   2. W przypadku górnej warstwy płytki TSC utrzymać pozostały stopiony agar TSC w temperaturze 40 °C.
      NUTA: Chociaż temperatura topnienia agaru przekracza 85 °C, stopiony agar krzepnie około 32–45 °C.
3. Ostrożnie pobrać kultury ON RPM i przenieść 100 μl na bazę agarową TSC. Z powodu fermentacji niektóre kultury mogą być pod presją. Upewnij się, że nosisz wszystkie odpowiednie środki ochrony osobistej.
4. Rozprowadź inokulum RPM za pomocą wysterylizowanych szklanych kulek lub rozsiewacza komórek.
5. Pozostaw RPM do "wchłonięcia" przez agar TSC przez 5–10 minut w temperaturze pokojowej.
6. Ostrożnie przenieść 20 ml stopionego agaru TSC o temperaturze 40 °C na płytkę za pomocą pipety serologicznej.
7. Załóż pokrywkę szalki Petriego i pozwól, aby agar TSC całkowicie zestalił się w temperaturze pokojowej.
8. Odwrócić szalkę Petriego i inkubować w temperaturze 37 °C ON.
9. Jeśli pożądane są seryjne rozcieńczenia, należy przeprowadzić rozcieńczenia kultur ON RPM do świeżego, wstępnie podgrzanego RPM przed inokulacją do agaru TSC.

4. Podhodowla kolonii redukujących siarczyny

1. Następnego ranka wyjmij płytki z inkubatora i sprawdź, czy nie rozwijają się bakterie. Bakterie tlenowe mogą być obecne na powierzchni agaru. Bakterie beztlenowe rosną w agarze i są osadzone w agarze . Bakterie redukujące siarczyny zmienią otaczający agar na. Możliwe kolonie C. perfringens będą czarne i osadzone w agarze .
2. Podejrzewane kolonie C. perfringens będą dodatnie pod względem redukcji siarczynów i będą wyglądać na czarne, osadzone w agarze . Za pomocą sterylnego, jednorazowego zakraplacza "zerw" czarne kolonie z agaru i przenieś do 10 ml świeżej prędkości obrotowej w stożkowej probówce o pojemności 15 ml. Ważne jest, aby powietrze z zakraplacza zostało usunięte przed przekłuciem agaru.
3. Jeśli na powierzchni płytki znajduje się gęsta ilość bakterii tlenowych, użyj sterylnego skrobaka do komórek, aby usunąć kolonie z wybranych obszarów. Z tej samej płytki TSC można pobrać próbki wielu kolonii podejrzanych o C . perfringens do oddzielnych kultur RPM.
4. Szczelnie zabezpiecz stożkowe pokrywki tubek i zawiń w folię parafinową lub folię spożywczą. Inkubować w temperaturze 37 °C.

Wyniki

Rysunek 1: Schemat techniki kanapkowej z agarem TSC.

Pożywki RPM zawierające bakterie C. perfringens są umieszczane między dwiema warstwami agaru TSC w celu promowania środowiska beztlenowego.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
D-cykloseryna	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał C6880
Dekstroza	Sigma Nauki przyrodnicze	D9434-250G
Jednorazowe pipety transferowe	dowolna marka		Wybierz taki z wąską końcówką, taki jak jednorazowe pipety transferowe Thermo Scientific 137116M/EMD
Zestawy do badania krwi i tkanek DNeasy	Qiagen powiedział:	69504	Uwaga: oceniono liczne zestawy do ekstrakcji DNA i plazmidu, ten zestaw dał najbardziej pożądane wyniki.
Suchy inkubator	dowolna marka
Płynne podłoże tioglikolanowe	Remel	R453452
Żelatyna ze skóry świni	Sigma Nauki przyrodnicze	G1890-500G
Siarczan żelaza (II) siedmiowodny	Sigma Nauki przyrodnicze	F8633-250 G
Lizozym z białka jaja kurzego	Sigma-Aldrich	L6876	Potrzebny do ekstrakcji DNA, brak w zestawie
Parafilm lub folia plastikowa	dowolna marka
Pepton z kazeiny i innych białek zwierzęcych	Sigma-Aldrich	70173-100G
Baza agarowa Perfringens (TSC + SFP)	Oxoid (Oxoid)	CM0587 powiedział:	Zrób agar TSC zgodnie z instrukcją
Fosforan potasu dwuzasadowy	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał P2222-100G
Chlorek sodu	Sigma-Aldrich	S-7653
Sterylny skrobak do komórek	dowolna marka
Rozsiewacz komórek sterylnych	dowolna marka
Sterylne szalki Petriego	dowolna marka
Ekstrakt drożdżowy	Sigma-Aldrich	70161-100G