Uproszczone oczyszczanie plazmidowego DNA z kultur prokariotycznych

Podsumowanie

Niniejszy protokół stanowi kosztowo efektywną alternatywę dla wydajnego równoległego klarowania i oczyszczania plazmidowego DNA z kultur E. coli. Proces AcroPrep Advance rozpoczyna się od zoptymalizowanej płyty filtracyjnej do klarowania lizatu, a następnie obejmuje oczyszczanie na płycie filtracyjnej do wiązania DNA o wysokiej pojemności wiązania.

Streszczenie

Opisujemy pełny proces wykorzystania płytek filtrujących AcroPrep Advance do preparatyki 96 plazmidów, począwszy od hodowli prokariontów, aż po uzyskanie wysokiej czystości DNA. Metoda ta, oparta na filtracji wielodołkowej w celu klarowania lizatu bakteryjnego i oczyszczania DNA, tworzy usprawniony proces preparatyki plazmidów. Płytki filtrujące zawierające nośniki krzemionkowe mogą być łatwo przetwarzane za pomocą filtracji próżniowej lub wirowania, co pozwala na uzyskanie znacznych ilości plazmidowego DNA. Analizy ilościowe wykazują, że oczyszczone plazmidowe DNA jest niezmiennie wysokiej jakości, ze średnimi stosunkami OD_260/280 na poziomie 1,97. Ogólnie rzecz biorąc, wydajność plazmidów zapewnia czystsze DNA do dalszych zastosowań, takich jak sekwencjonowanie i klonowanie. Ta usprawniona metoda wykorzystania płytek filtrujących AcroPrep Advance umożliwia przetwarzanie manualne, półautomatyczne lub w pełni zautomatyzowane.

Protokół

1. Oczyszczanie lizatu

1. Hodować kultury E. coli przekształcone pożądanym plazmidowym DNA w płytkach głębokich (1 mL kultury/dołek) w pożywce Luria Broth z odpowiednim antybiotykiem przez noc w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem.
2. Osadzić E. coli w płytce hodowlanej przy 5,000 x g przez 10 minut, a następnie odlać nadsącz.
3. Resuspendować każdy osad w 100 μL Buforu do Resuspensji (50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 10 mM EDTA, 100 μg/mL RNase A).
4. Dodać 100 μL/dołek Buforu do Lizy (200 mM NaOH, 1% SDS) i mieszać na wytrząsarce do płytek przez 2 minuty.
5. Dodać 100 μL/dołek Buforu Neutralizującego (3.0 M octanu potasu, pH 5.5) i mieszać przez 2 minuty.
6. Przenieść lizat komórkowy do płytki do klarowania lizatu.
7. Umieścić płytkę do wiązania DNA na górze płytki do zbierania o pojemności 350 μL i włożyć do dna kolektora próżniowego. Złożyć kolektor próżniowy (patrz Rycina 1).
8. Umieścić płytkę do klarowania lizatu na górze aparatu próżniowego.
9. Zastosować próżnię na poziomie 10 in. Hg (0.34 bar) i zebrać filtrat do płytki do wiązania DNA. Nie stosować próżni przekraczającej 12 in. Hg (0.41 bar).
10. Rozmontować kolektor próżniowy. Umieścić 2 mL płytkę do zbierania odpadów na dnie aparatu.

2. Wiązanie DNA

1. Przenieś płytkę do wiązania DNA na górną część kolektora (patrz Rysunek 2).
2. Dodaj 300 μL/dołek buforu wiążącego (6 M Guanidine-HCl) i wymieszaj, pipetując ciecz w górę i w dół.
3. Zastosuj próżnię [~ 5 in. Hg (0.17 bar dla powolnego odsysania] i odrzuć filtrat. DNA jest teraz związane z membraną.
4. Przemyj 400 μL/dołek buforu płuczącego (80% Ethanol).
5. Zastosuj próżnię, a następnie odrzuć filtrat. Krok ten jest zbędny w przypadku użycia płytki zbierającej o pojemności 2 mL lub filtrowania bezpośrednio do odpadów.
6. Powtórz płukanie raz.
7. Osusz dno płytki filtrującej, przykładając ją do chłonnego ręcznika.
8. Ponownie zastosuj próżnię przez 5-10 minut, aby zapewnić usunięcie resztek alkoholu.
9. Osusz dno, aby upewnić się, że usunięto krople etanolu.

3. Elucja DNA

1. Do każdego dołka należy dodać 70 μL Buforu do elucji (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA). W celu uzyskania wyższego stężenia DNA objętość można zmniejszyć do 50 μL/dołek, jednak średnia całkowita wydajność będzie wtedy niższa.
2. Płytkę należy inkubować w temperaturze pokojowej przez jedną minutę.
3. Oczyszczone DNA można eluować za pomocą próżni lub wirowania.
4. Metoda próżniowa: Czystą płytkę do zbierania (wolną od DNaz i RNaz) należy umieścić w manifoldzie próżniowym. Na górze manifolda należy umieścić płytkę filtrującą, a następnie zastosować próżnię o wartości 15 in. Hg (0.5 bar) przez 1 minutę, aż cały bufor do elucji przepłynie przez płytkę do wiązania DNA. Następnie należy zebrać oczyszczone DNA (patrz Rysunek 3).
5. Metoda wirowania: Płytkę filtrującą do oczyszczania należy umieścić na czystej płytce do zbierania i wirować z prędkością 1,000 x g przez 5 minut.

4. Analizy ilościowe i jakościowe

1. Zmierz OD_260/280 i oblicz stężenie oczyszczonego DNA.
2. Przeprowadź analizę oczyszczonego pDNA za pomocą żelu agarozowego.

5. Reprezentatywne wyniki

E. coli lizat oczyszczony przy użyciu tradycyjnego wirowania oraz płytek filtrujących do oczyszczania lizatów Pall AcroPrep Advance wykazał znaczną redukcję zanieczyszczeń z materiału wyjściowego. (Rycina 4).

Plazmidowe DNA w trzech stężeniach wprowadzono do buforu TE, a następnie przepuszczono przez płytkę filtrującą do klarowania lizatu AcroPrep Advance. Porównanie stężenia plazmidowego DNA przed i po filtracji wykazuje odzysk na poziomie ~100% (Rysunek 5) dla wszystkich trzech stężeń.

Aby zademonstrować odzysk DNA z klarownego lizatu E. coli, do surowego lizatu wprowadzono dawkę kontrolną plazmidowego DNA, a następnie poddano go klarowaniu poprzez filtrację. Tą samą ilość plazmidowego DNA dodano do lizatu komórkowego po filtracji. Elektroforezę przeprowadzono na alikwotach z każdej próbki (Rysunek 6). Pojedynczy, wyraźny prążek o zbliżonej intensywności w każdej próbce świadczy o niewielkiej lub żadnej utracie DNA podczas etapu klarowania opartego na filtracji.

Kultury E. coli zawierające plazmidowe DNA pCAT zostały oczyszczone z lizatów E. coli przy użyciu płytek filtracyjnych do wiązania DNA o pojemności 350 μL i 1 mL firmy Pall, a także dwóch innych marek płytek do wiązania DNA o pojemności 350 μL. Wszystkie procesy oczyszczania przeprowadzono zgodnie z zalecanym protokołem producenta. Najwyższe stężenie DNA oraz całkowita wydajność zostały odnotowane dla płytki filtracyjnej do oczyszczania DNA AcroPrep Advance 1 mL firmy Pall (Rycina 7 i Tabela 2).

Chociaż Konkurent W wykazuje również wysokie stężenie DNA (155 ng/μL), całkowita wydajność DNA jest najniższa (4.7 μg/well) ze względu na niską objętość odzysku, ~30 μL. Konkurent M zapewnił najniższe stężenie DNA wynoszące 108 ng/μL przy całkowitej wydajności 5.6 μg/well.

Analiza żelu agarozowego oczyszczonego DNA pCAT z trzech różnych płytek wiążących DNA przedstawiona jest na rysunku 8. Objętość każdej zebranej próbki została dostosowana do 65 μL, aby skorygować różnice w objętości odzysku przed elektroforezą. Wszystkie próbki wykazują obecność superzwiniętego DNA plazmidowego, jednak wydajność DNA z każdej z płytek filtrujących jest różna.

Rycina 9 pokazuje, że przygotowane DNA znajduje się w całości w formie superskręconej i ma podobne stężenie.

Rysunek 1. Montaż kolektora próżniowego do klarowania lizatu.

Rysunek 2. Montaż kolektora próżniowego do wiązania DNA.

Rysunek 3. Montaż kolektora próżniowego do elucji próżniowej.

Rycina 4. Filtracja upraszcza oczyszczanie próbki. Próbki potrójne o objętości 300 μL surowego lizatu oczyszczone za pomocą filtracji próżniowej (płyta filtrująca do oczyszczania lizatów AcroPrep Advance 350 μL) lub tradycyjnego wirowania. OD₃₂₀ zmierzone przed i po oczyszczaniu.

Rycina 5. Pełny odzysk pDNA po przejściu przez płytkę filtrującą do klarowania lizatów AcroPrep Advance. 300 μL buforu TE z dodatkiem pCAT w stężeniach 25, 50 i 100 μg/mL. Stężenie DNA i odzysk obliczone na podstawie OD₂₆₀ przed i po filtracji, N = 2.

Rycina 6. Odzysk DNA pCAT po klarowaniu. Równe ilości pUC19 dodane do lizatu przed lub po klarowaniu, a następnie rozcieńczone 1 do 10 w buforze TE. Na żel agarozowy 1,2% nałożono 2 μL na każdą ścieżkę.

Rysunek 7. Wyższa wydajność plazmidowego DNA na dołek przy użyciu płyty filtracyjnej do wiązania DNA pall Acroprep Advance w porównaniu z płytami konkurencji. Wydajność plazmidowego DNA pCAT (OD₂₆₀) przy użyciu wskazanych płyt do oczyszczania DNA z 1 mL (Pall i Konkurent M) lub 1,5 mL (Konkurent W) nocnej hodowli DH5α. Oczyszczanie przeprowadzono zgodnie z protokołem zalecanym przez producenta płyt. Słupki błędu oznaczają błąd standardowy (n > 6).

Rysunek 8. Analiza żelu agarozowego DNA pCAT oczyszczonego na wskazanej płytce do wiązania DNA. Elektroforeza żelowa na żelu agarozowym 1,2% oczyszczonego pDNA. Próbki połączone z trzech oddzielnych oczyszczeń, eluat skorygowany do 65 μL po oczyszczaniu, rozcieńczony 1:10. Na każdą ścieżkę naniesiono 2 μL.

Rysunek 9. Jakość i odzysk czystego DNA są podobne przy zastosowaniu wirowania lub próżni do końcowego zbierania eluatu; elektroforeza w żelu agarozowym oczyszczonego pDNA. W celu oczyszczania pDNA zastosowano protokół zalecany przez producenta dla płytek filtrujących AcroPrep Advance Filter Plates. Elucję przeprowadzono poprzez wirowanie przy 1,000 x g przez 5 minut lub za pomocą próżni przy 15 in. Hg (0.5 bar) przez 2 minuty.

Dyskusja

Opisujemy prosty, usprawniony protokół z użyciem płytek filtrujących AcroPrep Advance, który oferuje szereg zalet. Metoda ta zapewnia maksymalne wydajności plazmidowego DNA podczas przetwarzania w formatach AcroPrep Advance w trybie ręcznym, półautomatycznym lub w pełni zautomatyzowanym. Zintegrowany filtr wstępny na płytce do klarowania lizatu zapewnia spójną filtrację próbek, nawet tych zawierających wysoką zawartość cząstek stałych. Geometria dołków płytki pozwala na szybsze i bardziej jednorodne tempo filtracji w obrębie całej płytki przy minimalnej objętości zatrzymującej, a geometria końcówek wylotowych zapewnia bezpośredni przepływ próbek do płytki odbiorczej, eliminując ryzyko kontaminacji krzyżowej. Co ważne, membrana o wysokiej pojemności wiążącej w płytce do wiązania DNA systemu AcroPrep Advance jest zoptymalizowana pod kątem maksymalnego odzysku wysokiej jakości plazmidowego DNA.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Płytka filtrująca AcroPrep Advance	Pall Corporation	PN 8175 (1 mL) lub PN 8075 (350 µl)	Włókno szklane 3 μm, membrana Supor® 0,2 μm do klarowania
Płytka filtrująca AcroPrep Advance	Pall Corporation	PN 8132	do wiązania DNA
Kolektor próżniowy	Pall Corporation	PN 5017
Pompa próżniowa	Pall Corporation	PN 13157