$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Test posiewu
NUTA: Test posiewu mierzy stężenie komórek zdolnych do wytworzenia jednostki tworzącej kolonię (CFU) w próbkach hodowli. Procedura ta ujawnia szybkość, z jaką jedna komórka dzieli się na dwie żywotne komórki i umożliwia wykrycie zatrzymania podziału komórki (np. wydłużenie czasu generowania bakterii podczas lizy komórek).
- Przygotować 10-krotne seryjne rozcieńczenia do 10-7 z 200 μl próbki hodowli w świeżej pożywce. Płytka 100 μl odpowiedniego rozcieńczenia na nieselektywnych płytkach agarozowych Luria-Bertani (LB) w celu uzyskania między 3−300 koloniami po całonocnej inkubacji w temperaturze 37 °C. UWAGA: Seryjne rozcieńczanie w świeżej pożywce musi być przeprowadzone szybko w celu ograniczenia podziałów bakteryjnych. Alternatywnie, naukowcy mogą rozważyć użycie roztworu soli fizjologicznej bez źródła węgla, aby zapobiec podziałom komórek podczas procesu rozcieńczania.
- Następnego dnia policz liczbę kolonii, aby określić stężenie żywotnych komórek (CFU/ml) w każdej próbce hodowli. Wykreślić jtk/ml w funkcji czasu dla kultur komórkowych niepoddanych działaniu substancji i poddanych działaniu środka.
2. Cytometria przepływowa
NUTA: W poniższej sekcji opisano przygotowanie próbek komórek do analizy metodą cytometrii przepływowej. Ta technika analizy ujawnia rozkład wielkości komórek i zawartości DNA dla dużej liczby komórek. Jeśli to możliwe, zaleca się natychmiastowe przetworzenie próbek cytometrii przepływowej. Alternatywnie, próbki mogą być przechowywane na lodzie (do 6 godzin) i analizowane jednocześnie pod koniec dnia, po wykonaniu posiewu i obrazowania mikroskopowego.
- Rozcieńczyć 250 μl próbki hodowlanej, aby otrzymać 250 μl przy stężeniu ~15 000 komórek/μl (co odpowiada OD600nm ~0,06) w świeżej pożywce w temperaturze 4 °C.
NUTA: Inkubacja na lodzie ograniczy wzrost i modyfikację morfologiczną komórek. Alternatywnie, użytkownik może rozważyć wykonanie utrwalenia komórek w 75% etanolu, co jest zwykle zalecane w cytometrii przepływowej. - W przypadku barwienia DNA należy wymieszać próbkę bakteryjną z roztworem barwnika fluorescencyjnego DNA o stężeniu 10 μg/ml (w stosunku 1:1) i inkubować w ciemności przez 15 minut przed analizą próbki.
- Przełóż próbkę do cytometru przepływowego o natężeniu przepływu ~120 000 komórek/min. Pozyskiwanie światła rozproszonego do przodu (FSC) i rozproszonego bocznie (SSC) oraz sygnału fluorescencji barwnika fluorescencyjnego DNA (FL-1) przy odpowiednich ustawieniach.
- Wykreślić histogramy gęstości komórek FSC i FL-1, aby przedstawić rozkład wielkości komórek i zawartość DNA w populacji komórek.