Ocena filamentacji indukowanej antybiotykiem w E. coli za pomocą testu posiewu i cytometrii przepływowej

Streszczenie

Źródło: Cayron, J. i Lesterlin, C. Wieloskalowa analiza wzrostu bakterii w warunkach leczenia stresem. J. Vis. Exp. (2019 rok)

Ten film przedstawia procedurę oceny filamentacji E. coli i replikacji DNA w przypadku antybiotykoterapii hamującej podziały komórek przy użyciu posiewu do pomiaru żywotności i cytometrii przepływowej do analizy wielkości komórki i zawartości DNA.

Protokół

1. Test posiewu

NUTA: Test posiewu mierzy stężenie komórek zdolnych do wytworzenia jednostki tworzącej kolonię (CFU) w próbkach hodowli. Procedura ta ujawnia szybkość, z jaką jedna komórka dzieli się na dwie żywotne komórki i umożliwia wykrycie zatrzymania podziału komórki (np. wydłużenie czasu generowania bakterii podczas lizy komórek).

1. Przygotować 10-krotne seryjne rozcieńczenia do ^10-7 z 200 μl próbki hodowli w świeżej pożywce. Płytka 100 μl odpowiedniego rozcieńczenia na nieselektywnych płytkach agarozowych Luria-Bertani (LB) w celu uzyskania między 3−300 koloniami po całonocnej inkubacji w temperaturze 37 °C. UWAGA: Seryjne rozcieńczanie w świeżej pożywce musi być przeprowadzone szybko w celu ograniczenia podziałów bakteryjnych. Alternatywnie, naukowcy mogą rozważyć użycie roztworu soli fizjologicznej bez źródła węgla, aby zapobiec podziałom komórek podczas procesu rozcieńczania.
2. Następnego dnia policz liczbę kolonii, aby określić stężenie żywotnych komórek (CFU/ml) w każdej próbce hodowli. Wykreślić jtk/ml w funkcji czasu dla kultur komórkowych niepoddanych działaniu substancji i poddanych działaniu środka.

2. Cytometria przepływowa

NUTA: W poniższej sekcji opisano przygotowanie próbek komórek do analizy metodą cytometrii przepływowej. Ta technika analizy ujawnia rozkład wielkości komórek i zawartości DNA dla dużej liczby komórek. Jeśli to możliwe, zaleca się natychmiastowe przetworzenie próbek cytometrii przepływowej. Alternatywnie, próbki mogą być przechowywane na lodzie (do 6 godzin) i analizowane jednocześnie pod koniec dnia, po wykonaniu posiewu i obrazowania mikroskopowego.

1. Rozcieńczyć 250 μl próbki hodowlanej, aby otrzymać 250 μl przy stężeniu ~15 000 komórek/μl (co odpowiada OD_600nm ~0,06) w świeżej pożywce w temperaturze 4 °C.
   NUTA: Inkubacja na lodzie ograniczy wzrost i modyfikację morfologiczną komórek. Alternatywnie, użytkownik może rozważyć wykonanie utrwalenia komórek w 75% etanolu, co jest zwykle zalecane w cytometrii przepływowej.
2. W przypadku barwienia DNA należy wymieszać próbkę bakteryjną z roztworem barwnika fluorescencyjnego DNA o stężeniu 10 μg/ml (w stosunku 1:1) i inkubować w ciemności przez 15 minut przed analizą próbki.
3. Przełóż próbkę do cytometru przepływowego o natężeniu przepływu ~120 000 komórek/min. Pozyskiwanie światła rozproszonego do przodu (FSC) i rozproszonego bocznie (SSC) oraz sygnału fluorescencji barwnika fluorescencyjnego DNA (FL-1) przy odpowiednich ustawieniach.
4. Wykreślić histogramy gęstości komórek FSC i FL-1, aby przedstawić rozkład wielkości komórek i zawartość DNA w populacji komórek.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Agarozy	Przedsiębiorstwo BioRad	1613100	Certyfikowana biologia molekularna agaroza
Attune NxT Akustyczny cytometr ogniskowy	Naukowy ThermoFisher	Numer referencyjny A24858	Cytometr
Szczep E. coli przenoszący insercję chromosomową w celu fuzji hupA-mCherry			Stworzony przez transdukcję P1 hupA-mCherry w E. coli MG1655
Luria-Bulion agaroza podłoże	MP Biomedycyna	3002232	Pożywka wzrostowa do oznaczania posiewu
SYTO9 Zielona fluorescencyjna plama kwasu nukleinowego	Naukowy ThermoFisher	S34854 powiedział:	Barwnik fluorescencyjny DNA