Opisujemy opracowanie systemu selekcji negatywnej w E. histolytica opartego na transgenicznej ekspresji białka chimerycznego (FCU1) i selekcji przy użyciu proleku 5-fluorocytosyny. Białko FCU1 jest fuzją drożdżowej cytozynowej deaminazy i uracylu fosforobozylotransferazy. Ekspresja FCU1 doprowadziła do zwiększenia wrażliwości E. histolytica na 5-fluorocytosynę.
Artykuł metodologiczny
Opracowanie markeru selekcji negatywnej dla Entamoeba histolytica
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Entamoeba histolytica jest czynnikiem etiologicznym amebozy i infekuje do 10% populacji świata. Techniki molekularne umożliwiające nadekspresję i wyciszanie ekspresji genów opierają się na transfekcji stabilnie utrzymywanych plazmidów. Choć poszerzyły one naszą wiedzę na temat czynników wirulencji Entamoeba, możliwość integracji egzogennego DNA z genomem, co pozwoliłoby na przeprowadzenie eksperymentów z zakresu genetyki odwrotnej, stanowiłaby istotną zaletę w badaniach nad tym pasożytem. Wyzwania związane z tym organizmem obejmują brak możliwości selekcji zdarzeń rekombinacji homologicznej oraz trudności w usuwaniu episomalnego DNA plazmidowego z transfekowanych trofozoitów. To drugie prowadzi do wysokiego tła egzogennego DNA, co stanowi główny problem w identyfikacji trofozoitów, w których doszło do rzeczywistego zdarzenia integracji genomowej. Opisujemy opracowanie systemu selekcji negatywnej opartego na transgenicznej ekspresji chimery cytyzyny deaminazy i uracylu fosforobrylotransferazy drożdży (FCU1) oraz selekcji z użyciem proleku 5-fluorocytozyny (5-FC). Enzym FCU1 przekształca nietoksyczną 5-FC w toksyczny 5-fluorouracyl oraz 5-fluorurydynę-5'-monofosforan. Stwierdzono, że linie E. histolytica wykazujące ekspresję FCU1 są 30-krotnie bardziej wrażliwe na prolek w porównaniu ze szczepem kontrolnym.
Protokół
1. System negatywnej selekcji FCU w Entamoeba histolytica
- Linia kontrolna wektora (HM1/ pKT3M) oraz linia eksperymentalna (HM1/pKT3M-FCU1) zostały wytworzone zgodnie z wcześniej opisanymi technikami1,2. Przenieść linie badawcze z probówek zapasowych do kolbek T-25 i utrzymać selekcję poprzez dodanie odpowiedniego antybiotyku (12 μg/ mL G418) w pożywce TYI-S-33. Kolbki powinny osiągnąć 70-80% konfluencji po 16-18 godzinach wzrostu w temperaturze 37°C.
- Przygotować świeży 50mM roztwór zapasowy 5-fluorocytosyny (5-FC, Sigma) w ciepłej pożywce TYI-S-3. Intensywnie mieszać w wortexie przez kilka minut do całkowitego rozpuszczenia 5-FC. Roztwór zapasowy wysterylizować przez filtrację, przepuszczając go przez filtr 0,2 μm.
- Zebrać trofozoity, umieszczając kolbki na lodzie przez 3-5 minut, a następnie odwirować komórki przy 20xg przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Osad zawiesić w świeżej pożywce TYI i policzyć komórki.
- Projekt typowego eksperymentu zakłada użycie 0,5 x 104 komórek na każdą studzienkę płytki 48-dołkowej w końcowej objętości 1 mL; każda warunek testowy powtarzany jest w trzech powtórzeniach. Dodatkowo, aby ułatwić pomiary fluorescencji, dla każdego szczepu i każdego punktu czasowego stosuje się oddzielną płytkę.
- Zasiać 0,5 x 104 komórek na studzienkę dla każdego testowanego stężenia 5-FC, w trzech powtórzeniach. Utrzymać presję selekcyjną antybiotyku w pożywce TYI. Następnie dodać do każdej studzienki wymaganą ilość roztworu zapasowego 5-FC oraz trofozoity.
- Inkubować płytki w worku beztlenowym w temperaturze 37°C.
2. Wyznaczanie wydajności selekcji
- Przygotować roztwór stokowy Cell tracker green CMFDA (Invitrogen) o stężeniu 2 mg/mL w DMSO. Aby przygotować roztwór roboczy, należy rozcieńczyć roztwór stokowy 10-krotnie w bezserwatkowym medium TYI.
- Całkowicie usunąć medium z płytek z kulturą trofozoitów i zastąpić je 150 μL bezserwatkowego medium TYI zawierającego CMFDA. Kontynuować inkubację w temperaturze 37°C przez 1 h.
- Usunąć roztwór barwnika z dołków i odczytać wartości na płytce za pomocą spektrofluorometru do mikropłytek Spectramax M2. Długość fali wzbudzenia powinna być ustawiona na 492 nm, a emisja fluorescencji odczytywana przy 417 nm.
- Porównać wartości fluorescencji dla komórek kontrolnych oraz testowanych transfektantów.
- Kontynuować odczyty z płytek w każdym wyznaczonym odstępie czasu. W każdej płytce należy zastosować odpowiednie dołki kontrolne dodatnie (tylko TYI) i ujemne (25 μg/mL hygromycyny).
3. Reprezentatywne wyniki
Transfektanty E. histolytica wykazały silną ekspresję rekombinowanego FCU1 o zoptymalizowanych kodonach (Rycina 1). Prawidłowe zastosowanie tego protokołu prowadzi do selektywnej eliminacji komórek E. histolytica wykazujących ekspresję FCU1 w obecności 0,5 mM 5-fluorocytosyny. Komórki kontrolne, w przeciwieństwie do powyższych, nadal rosną normalnie przy stężeniu 5-FC do 5 mM i osiągają konfluencję w czasie od 72 do 96 h (Rycina 2-a). Komórki niosące FCU1 po 48 h ulegają całkowitej lizie, co jest widoczne podczas obserwacji traktowanych studni pod mikroskopem. Wykazują one również zmniejszoną fluorescencję po barwieniu barwnikiem żywotności CMFDA, który jest stosowany w badaniach ilościowych obejmujących dużą liczbę próbek (rycina 2-b). System FCU1/5-FC stanowi skuteczne i wydajne narzędzie do selekcji negatywnej trofozoitów E. histolytica.
Rysunek 1. Generowanie E. histolytica Transfektanty HM1 wykazujące ekspresję negatywnego markera selekcyjnego
(a) Rekombinacyjne białko FCU1 wykryto metodą western blot przy użyciu przeciwciała anty-c Myc (panel górny). Zgodnie z oczekiwaniami, prążek o masie 42 kDa (wskazany strzałką) był widoczny w całkowitym lizacie z transfektantów FCU, ale nie w transfektantach kontrolnych z samym wektorem. Panel dolny przedstawia ten sam blot poddany inkubacji z przeciwciałem anty-aktyną w celu kontroli ilości białka (loading control). (b) Wyniki ilościowego PCR w czasie rzeczywistym wykazujące ekspresję swoistego mRNA FCU1 znormalizowaną do kontroli lgl4.
Rysunek 2. In vitro wrażliwość na lek w przypadku *E. histolytica* transfekty wyrażające negatywny marker selekcyjny
Krzywe przeżycia (a) transfekty kontrolne i (b) transfektanty wykazujące ekspresję FCU1 hodowane na płytce 48-dołkowej. Komórki hodowano w obecności zwiększających się stężeń proleku – 5-fluorocytozyny; przeżywalność komórek określano za pomocą barwienia CMFDA w każdym przedziale czasowym wskazanym na osi X. Oś Y przedstawia jednostki fluorescencji i jest bezpośrednim odzwierciedleniem przeżywającej populacji komórek. Należy zauważyć, że transfektanty wykazujące ekspresję FCU1 wykazały znaczną wrażliwość przy stężeniu proleku 0,5 mM w porównaniu z grupą kontrolną. W tych dołkach nie zaobserwowano komórek w punkcie czasowym 120 h, w przeciwieństwie do konfluencyjnego wzrostu widocznego pod mikroskopem w odpowiadających im dołkach kontrolnych (dane nie zostały przedstawione). Hygro oznacza 25μg/ mL hygromycyny użytej jako kontrola negatywna.
Dyskusja
Mimo znacznych postępów w narzędziach biologii molekularnej dotyczących Entamoeba, obecnie nie istnieją dostępne metody usuwania lub zakłócania genów4. Wyciszenie specyficznej ekspresji genów osiągnięto poprzez zastosowanie rybinowych RNA (hairpin RNA)5, małych interferujących RNA6 oraz bakteryjnie ekspresowanego dsRNA7. Jednak metody te, choć skuteczne dla odpowiednich genów docelowych, mają kilka ograniczeń, w tym stosowanie kosztownych odczynników chemicznych, ciągłą selekcję przy użyciu antybiotyków oraz konieczność stałej walidacji ze względu na wysoką częstotliwość występowania rewersji w czasie (Alicia Linford, komunikacja osobista)8.
Każdy plazmid może replikować się w Entamoeba, ponieważ najwyraźniej nie istnieją rygorystyczne wymagania sekwencyjne dla miejsc inicjacji replikacji DNA9, przez co po transfekcji zazwyczaj trudno jest usunąć plazmid. Ogranicza to możliwość wykorzystania nienaruszonych plazmidów w eksperymentach z rekombinacją i knockoutem genów. Markery selekcji negatywnej są kluczowymi elementami metod celowania w geny, ponieważ mogą być wykorzystywane do eliminacji rekombinowanych subpopulacji. Z powodzeniem wyraziliśmy gen FCU1 o zoptymalizowanych kodonach w Entamoeba histolytica i przetestowaliśmy jego potencjał jako negatywnego markera selekcyjnego. Ta fuzja genowa była stosowana w terapii genowej typu „gen samobójczy” w komórkach nowotworowych ludzi i metabolizuje prolek 5-FC do toksycznych produktów końcowych, co prowadzi do zahamowania syntezy RNA i DNA10. FCU1 był ostatnio stosowany jako negatywny marker selekcyjny w Plasmodium, innym pierwotniaku pasożytniczym. Stwierdzono, że komórki Plasmodium berghei wykazujące ekspresję FCU1 są niemal 1000-krotnie bardziej wrażliwe na prolek in vitro, a leczenie 5-FC in vivo zabiło ponad 99,9% zakaźnych rekombinowanych pasożytów w mysim modelu malarii w stadium erytrocytarnym11. Komórki E. histolytica wykazujące ekspresję FCU1 wykazały jedynie 30-krotny wzrost wrażliwości na prolek 5-FC, w przeciwieństwie do wrażliwości zaobserwowanej u P. berghei. Możliwą przyczyną tego stanu może być duża pula nukleotydów dostępna w medium hodowlanym, konkurująca z toksycznymi metabolitami.
Zarówno w P. berghei, jak i w P. falciparum marker FCU1 był wykorzystywany w badaniach nad celowaną disruptią genów11,12. Naszym celem jest manipulacja genomem Entamoeba przy użyciu rekombinacji homologicznej. Walidacja systemu selekcji negatywnej FCU1/5-FC jest istotnym krokiem w stronę osiągnięcia tego celu.
Oświadczenia
Produkcja tego filmu została sfinansowana przez Sigma Aldrich, Inc, firmę produkującą część odczynników wykorzystanych w niniejszym artykule.
Podziękowania
Pragniemy podziękować dr. Philippe'owi Erbsowi za udostępnienie nam sekwencji genu FCU1. Praca ta była finansowana z grantu NIH AI 26649.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| pożywka TYI-S-33 | ATCC | Referencja zawarta w tekście | |
| 5-fluorocytozyna | Sigma-Aldrich | F7129 | |
| Cell tracker green CMFDA | Invitrogen | C2925 | |
| czytnik płytek Spectra Max M2 | Molecular Devices |
Bibliografia
- Olvera, A. Stable transfection of Entamoeba histolytica trophozoites by lipofection. Arch. Med. Res. , 49-51 (1997).
- Saito-Nakano, Y., Yasuda, T., Nakada-Tsukui, K., Leippe, M., Nozaki, T. Rab5-associated vacuoles play a unique role in phagocytosis of the enteric protozoan parasite Entamoeba histolytica. J. Biol. Chem. 279, 49497-49507 (2004).
- Diamond, L. S., Harlow, D. R., Cunnick, C. C. A new medium for the axenic cultivation of Entamoeba histolytica and other Entamoeba. Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 72, 431-432 (1978).
- Clark, C. Anaerobic parasitic protozoa : genomics and molecular biology. , Caister Academic. Norfolk UK. (2010).
- Linford, A. S. Short hairpin RNA-mediated knockdown of protein expression in Entamoeba histolytica. BMC Microbiol. 9, 38-38 (2009).
- Solis, C. F., Guillén, N. Silencing genes by RNA interference in the protozoan parasite Entamoeba histolytica. Methods Mol. Biol. 442, 113-128 (2008).
- Solis, C. F., Santi-Rocca, J., Perdomo, D., Weber, C., Guillén, N. Use of bacterially expressed dsRNA to downregulate Entamoeba histolytica gene expression. PLoS ONE. 4, e8424-e8424 (2009).
- MacFarlane, R. C., Singh, U. Loss of dsRNA-based gene silencing in Entamoeba histolytica: implications for approaches to genetic analysis. Exp. Parasitol. 119, 296-300 (2008).
- Dhar, S. K., Vines, R. R., Bhattacharya, S., Petri, W. A. Ribosomal DNA fragments enhance the stability of transfected DNA in Entamoeba histolytica. J. Eukaryot. Microbiol. 45, 656-660 (1998).
- Erbs, P. In vivo cancer gene therapy by adenovirus-mediated transfer of a bifunctional yeast cytosine deaminase/uracil phosphoribosyltransferase fusion gene. Cancer Res. 60, 3813-3822 (2000).
- Braks, J. A. M., Franke-Fayard, B., Kroeze, H., Janse, C. J., Waters, A. P. Development and application of a positive-negative selectable marker system for use in reverse genetics in Plasmodium. Nucleic Acids Res. 34, e39-e39 (2006).
- Maier, A. G., Braks, J. A. M., Waters, A. P., Cowman, A. F. Negative selection using yeast cytosine deaminase/uracil phosphoribosyl transferase in Plasmodium falciparum for targeted gene deletion by double crossover recombination. Mol. Biochem. Parasitol. 150, 118-121 (2006).
Przedruki i uprawnienia
