Oczyszczanie rekombinowanych białek domeny P pochodzących z bakterii ludzkiego norowirusa

Streszczenie

Źródło: Leuthold, M. M., et al. Wytwarzanie ludzkich domen wystających norowirusa w E. coli do krystalografii rentgenowskiej. J. Vis. Exp. (2016).

Ten film demonstruje oczyszczanie rekombinowanej domeny P ludzkiego norowirusa P za pomocą chromatografii wykluczania wielkości, podkreślając oddzielenie białka docelowego od zanieczyszczeń o wyższej i niższej masie cząsteczkowej w oparciu o różnicową dostępność porów. Proces jest monitorowany za pomocą absorbancji UV i potwierdzany za pomocą analizy SDS-PAGE frakcji eluowanych.

Protokół

1. Trzeci etap oczyszczania

1. Umyć pompy i rury systemu oczyszczania HPLC (wysokosprawna chromatografia cieczowa) i wstępnie zrównoważyć kolumnę SEC (chromatografia wykluczania wielkości) (patrz Lista materiałów) z GFB (żelowy bufor filtracyjny).
2. Wprowadzić domenę P do kolumny z szybkością przepływu 1 ml/min za pomocą superpętli (do 12 ml) lub pętli (do 3 ml), w zależności od objętości zagęszczonej próbki. Po zakończeniu wstrzykiwania należy zwiększyć szybkość przepływu do 2,5 ml/min.
3. Wraz ze wzrostem OD (gęstości optycznej) i odejściem domeny P z kolumny, zbierz frakcje 1,5 ml. Sprawdź frakcje za pomocą SDS-PAGE z 12% żelem (Rysunek 1A i 1B). Zebrać tylko najczystsze frakcje i skoncentrować do ~ 3 mg/ml i ~ 8 mg/ml.
   Uwaga: Po ~110 ml (objętość pustka) większość zanieczyszczeń jest eluowana z kolumny SEC o objętości złoża 320 ml. Domena P jest zwykle eluowana jako dimer. Czas/objętość elucji dimeru domeny P zależy od stopnia przygotowania (pg) kolumny SEC.

Wyniki

Rysunek 1. Schematyczne i reprezentatywne wyniki dla 3. etapu oczyszczania.
Chromatogram elucji w domenie P przy użyciu SEC i odpowiadającego mu wyniku SDS-PAGE. Czarne liczby wskazują zebrane ułamki. A) Schemat separacji...

Materiały