Pomiar wiązania leku z kazeum ze zmian gruźliczych za pomocą metody szybkiej dializy równowagowej

Streszczenie

Źródło: Sarathy, J. P. i wsp. Test wiązania kazeum in vitro , który przewiduje przenikanie leku do zmian gruźliczych. J. Vis. Exp. (2017)

Ten film przedstawia test in vitro do pomiaru wiązania leku z kazeum ze zmian gruźlicy przy użyciu szybkiej dializy równowagowej. Przedstawiono w nim etapy przygotowywania zawiesin kazeum, wykonywania dializy i obliczania niezwiązanej frakcji leku w celu przewidzenia przenikania leku do kazeum.

Protokół

1. Test dializy szybkiej równowagi (RED)

1. Dodać 6,5 μl z 500 μM roztworu badanego związku do 643,5 μL homogenatu, aby uzyskać końcowe stężenie 5 μM (≤1% DMSO) i zawirować.
2. Umieść CZERWONE wkładki w płycie podstawy. Dodać 200 μl matrycy wzbogaconej lekiem do komory dawczej (czerwony pierścień) każdej wkładki RED i 350 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) do każdej komory odbiorczej. Przygotować 3 inserty dla każdego badanego związku (trzy próbki). Uszczelnić płytkę z płytką samoprzylepną, uszczelnić i inkubować w temperaturze 37 °C na termomieszaczu przy 200 obr./min (1 x g) przez 4 godziny.
3. Po inkubacji delikatnie wymieszać zawartość komory dawczej i biorczej, pipetując w górę i w dół 2-3 razy. Odpipetować 20 μl podwielokrotności homogenatu z komór dawczych i dodać do 20 μl czystego PBS w probówce o pojemności 1,5 ml (1:1). Podobnie, odpipetować 20 μl porcji próbek PBS z komór odbiorczych i dodać do 20 μl czystego homogenatu (dopasowanie matrycy).
   NUTA: Dopasowanie matrycy eliminuje potrzebę wykonywania 2 oddzielnych krzywych kalibracyjnych (w homogenacie i PBS) do analizy ilościowej. Zawartość komory dawczej może z czasem osadzać się. Delikatnie wymieszać zawartość przez pipetowanie przed usunięciem podwielokrotności.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Płyta podstawy wielokrotnego użytku urządzenia Pierce RED	Fisher Naukowy	Przekaźnik PI-89811
Wkłady do urządzeń Pierce RED, 50 sztuk w pudełku	Fisher Naukowy	Numer identyfikacyjny PI-89809
Narzędzie do usuwania wkładek Pierce RED	Fisher Naukowy	89812
Uszczelka samoprzylepna	Fisher Naukowy	08-408-240
PBS, pH 7,4, 10x 500 ml (Gibco)	Technologie życiowe	10010-049
DMSO	Sigma	472301