Produkcja i osadzanie zarodników Bacillus subtilis w aerozolu

Streszczenie

Źródło: Fuchs, F. M., et al. Badanie szkodliwego wpływu niskociśnieniowej sterylizacji plazmowej na przetrwanie zarodników Bacillus subtilis przy użyciu mikroskopii żywych komórek. J. Vis. Exp. (2017)

Ten film demonstruje produkcję, oczyszczanie i osadzanie zarodników Bacillus subtilis w aerozolu w celu stworzenia jednolitej monowarstwy, umożliwiającej dalsze zastosowania, takie jak analiza mikroskopowa kiełkowania, żywotności lub reakcji na stres zarodników.

Protokół

1. Produkcja i oczyszczanie zarodników Bacillus subtilis

1. W celu produkcji przetrwalników przenieść 5 ml nocnej kultury odpowiedniego szczepu B. subtilis , uzupełnionej odpowiednimi antybiotykami, do 200 ml płynnej pożywki zarodnikowej Schaeffera o podwójnej mocy (na litr 16 g bulionu odżywczego, KCl (chlorek potasu) 2 g, 0,5 g MgSO₄*7 H₂O (siarczan magnezu siedmiowodny), 2 ml 1 M Ca(NO₃)₂ (azotan wapnia), 2 ml 0,1 M MnCl₂ *• 4 H₂O (czterowodny chlorek manganu), 2 ml 1 mM_FeSO4 (siarczan żelazawy), 2 ml 50% (w/v) glukozy18) i uprawiać z energicznym napowietrzaniem w temperaturze 37 °C przez 72 godziny lub do momentu> gdy 95% kultury ulegnie zarodnikowaniu. Wykorzystywane są zarodniki następujących szczepów: B. subtilis PY79 (typ dziki) B. subtilis PY79ΔrecA::neo (niedobór białka naprawy DNA RecA) B. subtilis PY79 recA-yfp::cat (RecA połączony z białkiem żółtej fluorescencji [YFP]).
2. Zebrać zarodniki przez wirowanie przez 15 minut przy 3 000 x g w probówkach o pojemności 50 ml i oczyścić próbki przez wielokrotne mycie (do 15 razy) przy użyciu sterylnego destylowanego_H2Oi sprawdzić czystość i stan kiełkowania za pomocą mikroskopii z kontrastem fazowym. Upewnij się, że zawiesiny zarodników składają się z zarodników jasnych fazowo (> 99%) i są wolne od komórek wegetatywnych (pręcików), kiełkujących zarodników (wygląd/szary) i resztek komórkowych; W przeciwnym razie dalsze eksperymenty mikroskopowe mogą zostać zakłócone. Myć próbkę aż do osiągnięcia pożądanej czystości.
3. Oznaczyć miano przetrwalników, rozsiewając 50 μl 10-krotnych seryjnych rozcieńczeń na agarze LB (luria-bertani) (tj.: Użyć 30 μl próbki + 270 μl sterylnej wody do rozcieńczenia 1:10. Pobrać 30 μl z danego rozcieńczenia do 270 μl_H2Odla rozcieńczenia 1:100 i tak dalej) w celu obliczenia CFU (jednostek tworzących kolonie) i inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez noc. Po oznaczeniu CFU dostosować próbkę do 10-9 zarodników na ml, zagęszczając lub rozcieńczając sterylną wodą.

2. Przygotowanie próbki zarodników Bacillus subtilis osadzonych w aerozolu

NUTA: Nagromadzenie i nakładanie się zarodników może prowadzić do efektu zacienienia podczas zabiegu, co ostatecznie prowadzi do sfałszowanej kinetyki inaktywacji. Aby zminimalizować ten problem, należy przygotować próbki zarodników techniką osadzania w aerozolu. Krótko mówiąc, steruj precyzyjną dyszą dwusubstancyjną za pomocą elektrycznego timera, który reguluje przepływ cieczy wraz z przepływem sprężonego gazu nośnego (tutaj N₂). Rozproszyć wstrzykniętą próbkę cieczy przez wylot dyszy za pomocą przepływu azotu gazowego.

1. Umieścić nośnik próbki w postaci wysterylizowanych szkiełek mikroskopowych (do kinetyki przeżycia) lub okrągłych szkiełek nakrywkowych o średnicy 25 mm (do fluorescencyjnego śledzenia procesów naprawy DNA/cLSM; konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej) wewnątrz elektrycznie sterowanego urządzenia do rozpylania aerozoli w jednej linii z dyszą. Użyte stężenie zarodników musi odpowiadać stukrotności pożądanego stężenia końcowego.
2. Przenieść 1 ml kultury przetrwalników do wlotu płynu dyszy i rozpocząć proces opryskiwania trwający 0,1 s pod ciśnieniem 1,3 bara. Rozpylona zawiesina zarodników (1 x 10⁷) tworzy cienką warstwę na mikroskopijnym szkiełku, która szybko wysycha w ciągu kilku sekund, tworząc równomiernie rozłożoną monowarstwę zarodników. Nośniki próbek poddanych działaniu substancji należy przechowywać w sterylnym pojemniku w temperaturze pokojowej.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Dysza do dwóch substancji (model 970-8)	Schlick	14,404	230 V, 50 Hz, D 4.484/8, średnica otworu 0,8 mm
Luria Bertani Medium	Sigma Aldrich	70122-100G
Łączniki rurowe	Festo	N/a	G 1/8
Szkiełka szklane	Firma VWR	48300-026
Komora celna attofluorowa	Menzel, Fisher Ref.	3406816	d=25 mm, okrągły
Siarczan magnezu siedmiowodny	Sigma Aldrich	13152
Azotan wapnia	Sigma Aldrich	202967
Chlorek manganu czterowodny	Sigma Aldrich	244589
Siarczan żelazawy	Zastosowanie	13446-34-9
Glukoza	Merck	215422
Chlorek potasu	Sigma Aldrich	Zobacz materiał P9541-500G
Bulion odżywczy (NB)	Merck	105443
Luria-Bertani (LB)	Merck	110283
Płytka 96-dołkowa	Rybak termiczny	243656