Przygotowanie sztucznej pożywki z plwociny w celu naśladowania mukowiscydozy i plwociny płucnej ex vivo

Streszczenie

Źródło: Vieira, J., et al. Zaprojektowanie i opracowanie modelu do badania wpływu dodatkowego tlenu na mikrobiom dróg oddechowych mukowiscydozy. J. Vis. Exp. (2021).

Ten film przedstawia przygotowanie sztucznej pożywki z plwociny, która naśladuje lepkość, skład składników odżywczych i pH plwociny płucnej mukowiscydozy. Otrzymana w ten sposób pożywka stanowi fizjologicznie istotną platformę do badań ex vivo.

Protokół

1. Preparat ze sztucznej plwociny

NUTA: Podane tutaj ilości dotyczą produkcji 1 litra końcowego podłoża ze sztucznej plwociny i zakładają konkretne odczynniki wymienione w Tabeli Materiałów. Liczby muszą być dostosowane do innych objętości lub do użycia różnych odczynników, aby zapewnić ten sam produkt końcowy. Patrz tabela 1 w odniesieniu do stężeń docelowych.

1. Mieszanina chemiczna sztucznej plwociny (ASCM)
   NUTA: ASCM stanowi 25% końcowej objętości nośnika. Jest stabilny na półce i może być przygotowywany luzem lub z wyprzedzeniem. Jeśli jest przygotowywana do późniejszego użycia, należy ją autoklawować w autoklawie i bezpiecznie przechowywać w temperaturze pokojowej.
   1. Wymieszać podstawowe roztwory chemiczne wchodzące w skład tej mieszanki.
      1. Przygotuj 1 M bulionu NaCl: Dodaj 58,44 g NaCl na litr sterylnej wody.
      2. Przygotuj 1 M bulionu KCl: Dodaj 74,55 g KCl na litr sterylnej wody.
      3. Przygotować 1 M bulionu_MgSO4 : Dodać 246,47 g MgSO₄·7H₂O na litr sterylnej wody lub 120,37 g bezwodnego_MgSO4 na litr sterylnej wody.
      4. Przygotuj 1 M bulionu glukozy: Dodaj 180,16 g glukozy na litr sterylnej wody.
   2. Wysterylizuj w autoklawie roztwory podstawowe chemikaliów, a także pustą butelkę o pojemności 250 ml. Etapy autoklawowania należy wykonywać do co najmniej standardowych wartości 121 °C i 15 PSI przez 30 minut.
   3. Dodaj 80,59 ml sterylnej wody do pustej butelki o pojemności 250 ml.
   4. Dodać do mieszanki 152,30 ml 1 M bulionu NaCl.
   5. Dodaj do mieszanki 15,8 ml 1 M bulionu KCl.
   6. Do mieszanki dodać 610 μl 1 M bulionu_MgSO4 .
   7. Do mieszanki dodać 700 μl 1 M bulionu glukozowego.
2. Mieszanina mucyny ze sztuczną plwociną (ASMM)
   NUTA: ASMM stanowi 50% końcowej objętości nośnika. Upewnij się, że jest przygotowany tego samego dnia, co ostatnia partia pożywki.
   1. Dodaj 450 ml sterylnej wody do pustej butelki o pojemności 1 l.
   2. Dodaj 50 ml 10x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) do butelki.
   3. Dodaj jednorazowy magnetyczny mieszadło do butelki.
   4. Butelkę zawierającą PBS i mieszadło należy sterylizować w autoklawie.
   5. Odmierz 10 g mucyny w proszku i dodaj ją do PBS.
   6. Energicznie wstrząśnij butelką w celu wstępnego wymieszania.
   7. Umieść butelkę na płycie grzejnej z mieszadłem magnetycznym. Ustaw ogień na średnio-wysoki, celując w 50 °C i prędkość mieszania na 1100 obr./min. Stopniowo zwiększaj prędkość, aby pręt nie spadł z magnesu.
      1. Pozostawić do podgrzania i mieszać przez 15 minut.
      2. Podnieś butelkę w żaroodpornych rękawicach. Obserwuj, aby sprawdzić, czy mucyna w proszku osiada z roztworu.
      3. Jeśli mucyna w proszku nie jest całkowicie rozpuszczona, włóż butelkę z powrotem do podgrzewacza/mieszadła w odstępach 5-minutowych, aż do całkowitego rozpuszczenia.
   8. Pozwól mieszaninie mucyny ostygnąć do temperatury pokojowej.
3. Mieszanka biologiczna sztucznej plwociny (ASBM)
   NUTA: ASBM stanowi 25% końcowej objętości nośnika. Przygotuj go tego samego dnia, co końcową pożywkę i w przeciwieństwie do innych mieszanek, nie wystawiaj jego składników na działanie ciepła.
   1. Rozmrozić 100x bulion witaminowy w lodówce o temperaturze 4°C lub na lodzie. ​
      NUTA: Wstępnie podziel zapas witamin na 10 ml porcji, aby zminimalizować liczbę cykli zamrażania/rozmrażania.
   2. Dodaj 124,24 ml sterylnej wody do pustej autoklawizowanej butelki o pojemności 250 ml.
   3. Dodaj do mieszanki 25,76 ml 50x zapasu aminokwasów egzogennych.
   4. Dodaj do mieszanki 80,14 ml 100x zapasu aminokwasów endogennych.
   5. Dodaj do mieszanki 10 ml (rozmrożonego) bulionu witaminowego 100x.
   6. Dodaj do mieszanki 1 ml bulionu 1000x z metali śladowych.
   7. Dodaj do mieszanki 8,33 ml 30% emulsji z żółtka jaja.
   8. Do mieszanki dodać 400 μl bulionu ferrytynowego o gramaturze 10 g/l.
   9. Dobrze wymieszaj roztwór, ręcznie wstrząsając.
4. Sztuczna pożywka z plwociną (ASM)
   1. Dodać 250 ml ASCM do 1-litrowej butelki zawierającej ASMM.
   2. Dodać 250 ml ASBM do średniej butelki.
   3. Miareczkować pożywkę podstawowym buforem MOPS (1 M), aby osiągnąć pH 6,3 na bibułce o wąskim zakresie. Przed miareczkowaniem mieszanina pożywki będzie zbyt kwaśna.
   4. Otrzymaną sztuczną pożywkę z plwociny należy przechowywać w lodówce w temperaturze 4 °C, aż będzie gotowa do filtracji.
   5. Aby rozpocząć proces filtracji, przenieś 200 ml niefiltrowanej sztucznej plwociny do systemu filtracji próżniowej z filtrem o wielkości porów 0,22 μm.
   6. Podłączyć system filtracji do pompy próżniowej, włączyć pompę próżniową, ustawić ją na 70 mbar, a następnie umieścić komorę na wytrząsarce orbitalnej wytrząsającej z prędkością 90 obr./min w chłodni w temperaturze 4 °C.
      1. Uzupełnij dodatkowymi 150 ml pożywki, ponieważ znaczna ilość jest filtrowana. Całkowite przefiltrowanie 1 l podłoża zajmuje 1-2 dni.
      2. Powtórz z dodatkowymi komorami, aż wszystkie media zostaną przefiltrowane.
         NUTA: Staraj się nie filtrować więcej niż 350 ml pożywki przez ten sam filtr 0,22 μm, ponieważ mucyna z czasem zatka filtr.
   7. Przefiltrowaną pożywkę ze sztuczną plwociną przechowywać w lodówce w temperaturze 4 °C, aż będzie gotowa do użycia. Użyj ASM w ciągu jednego miesiąca od przygotowania, aby uzyskać najlepsze rezultaty.

Tabela 1: Receptura sztucznej pożywki z plwociny na podstawie przeglądu literatury. (Kolumna 1) Odczynniki i kluczowe wartości w formulacji sztucznej pożywki z plwociny. (Kolumny 2-7) Porównanie przepisów z zachowanej literatury. (Kolumny 8-9).

Kolumna 1		Kolumna 2	Kolumna 3	Kolumna 4	Kolumna 5	Kolumna 6	Kolumna 7	Kolumna 8	Kolumna 9
Wartość		Comstock	Kirchner	Sriramulu powiedział:	Palmer	Flynn	Gallagher	Lai	Źródło
Mucyny		2% w/v	0,5% m/v	0,5% m/v	-	1% w/v	2% w/v	1% w/v	Flynn
Chlorek sodu		85,5 mln	85,5 mln	85,5 mln	66,6 mln	89,8 mln	85,5 mln	152,3 mln	Lapierre powiedział:
Chlorek potasu		29,5 mM	29,5 mM	29,5 mM	15,8 mln	-	2,95 mln	15,8 mln	Palmer
Siarczan magnezu		-	-	-	0,6 mM	1 mM	1 mM	0,61 mM	Palmer
Siarczan żelaza		-	-	-	0,0036 mM	-	-	-	-
Chlorek amonu		-	-	-	2,3 mln	60 mM	-	-	-
Fosforan monopotasowy		-	-	-	2,5 mM	60 mM	-	-	-
Glukoza		-	-	-	3,2 mM	13 mM	40 mM	0,7 mM	Sambeek powiedział:
Mleczan		-	-	-	9 mM	-	-	-	-
Aminokwasy egzogenne		14,45 razy	0,25 g/l	0,25 g/l	Na kwas	0,5 razy	0,375 razy	1,29x	Palmer
Aminokwasy endogenne		28,9x	0,25 g/l	0,25 g/l	Na kwas	0,25 razy	0,5 razy	8,01x	Palmer
Witaminy		-	-	-	-	-	1x	1x	Gallagher
Metale śladowe		-	-	-	-	1x	1x	1x	Flynn
Żółtko		0.25%	0.25%	0.25%	-	-	0.25%	0.25%	Kirchner
Ferrytyny		0,0003 g/l	-	-	-	-	0,0004 g/l	0,0004 g/l	Gallagher
DNA plemników łososia		1,4 g/l	4 g/l	4 g/l	-	-	1,4 g/l	-	-
Protokół DPTA (Jednostka T		-	-	0,0059 g/l	-	-	-	-	-
ph		-	6.9	-	6.8	-	-	6.3	Lapierre powiedział:
Składowanie		0	4°	-	-	4°	4°	4°	Kirchner
Sterylizacja		Autoklaw	Filtr	Autoklaw	-	Autoklaw	Autoklaw	Filtr	Kirchner

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Roztwór witamin BME (100x)	MiliporeSigma	Zobacz materiał B6891	Skoncentrowany roztwór uzupełniających witamin.
Zaciskarka, 30 mm	DWK Nauki Przyrodnicze	224307	Zaciskarka do mocowania aluminiowych uszczelek do butelek z serum.
D-(+)-glukoza	MiliporeSigma	Kontroler G7021	Glukoza w postaci stałej w proszku (izomer prawoskrętny).
Pompa membranowa ME 2 NT	MARKA VACUU	20730003	Pompa próżniowa do filtracji próżniowej.
Emulsja z żółtka jaja	HiMedia	FD045 powiedział:	Sterylna emulsja 30% żółtka jaja w soli fizjologicznej.
Ferrytyna, kationowana ze śledziony konia	MiliporeSigma	Zobacz materiał F7879	Roztwór ferrytyny (białka magazynującego żelazo).
FIREBOY plus Bezpieczny palnik Bunsena	Integra Biosciences	144000	Palnik Bunsena z interfejsem użytkownika i funkcjami bezpieczeństwa.
Bibułka pH Hydrionu (1,0–14,0)	Laboratorium Micro Essential	94	Bibuła do badań pH w zakresie 1,0–14,0.
Papier pH Hydrion (4,0–9,0)	Laboratorium Micro Essential	55	Bibuła do badań pH w zakresie 4,0–9,0.
Bibułka pH Hydrionu (6,0–8,0)	Laboratorium Micro Essential	345	Bibuła do badań pH w zakresie 6,0–8,0.
Urządzenie zabezpieczające Hypodermic Needle-Pro EDGE, 18 g	Smiths Medical	401815	Igły 18 G z nasadkami zabezpieczającymi.
Manometr liniowy	MiliporeSigma	20469	Manometr gazu do monitorowania ciśnienia w butle.
Wytrząsarka inkubowana Innova 42	Eppendorf powiedział:	2231000756	Kombinowany inkubator/wytrząsarka orbitalna.
Strzykawka Luer-Lok z dołączoną igłą	Becton Dickinson	309580	Kombinacja strzykawki 3 ml i igły 18 G.
Asortyment zaworów Luer	Światowe instrumenty precyzyjne	14011	Zawory do przewodów przepływających gaz.
Wytrząsarka orbitalna LSE	ThermoFisher Naukowy	6780-NP	Wytrząsarka orbitalna do mieszania mediów podczas filtracji.
Siarczan magnezu siedmiowodny	MiliporeSigma	Zobacz materiał M2773	Stała sól epsom (siarczan magnezu siedmiowodny).
Jednostopniowy regulator powietrza medycznego z przepływomierzem	Zachodnie przedsiębiorstwa	M1-346-15FM	Regulator przepływu powietrza z miernikiem 15 l/min.
Aminokwasy MEM (50x) Roztwór	MiliporeSigma	Zobacz materiał M5550	Skoncentrowany roztwór aminokwasów egzogennych.
MEM Aminokwasy endogenne (100x) Roztwór	MiliporeSigma	Zobacz materiał M7145	Skoncentrowany roztwór aminokwasów endogennych.
Filtr Millex-GP, 0,22 μm	MiliporeSigma	SLMP25SS	Sterylny filtr strzykawkowy z membraną polieterosulfonową 0,22 μm.
Milli-Q Akademicki	MiliporeSigma	ZMQS60E01	System filtracji sterylnej wody Milli-Q.
Monitor tlenu MiniOX 3000	MSA	814365	Monitor procentowy przepływu tlenu w przepływie gazu.
Bufor MOPS (1 m, pH 9,0)	Produkty biologiczne Boston	BBM-90	Bufor MOPS do regulacji pH mediów.
Mucyna z żołądka wieprzowego	MiliporeSigma	Zobacz materiał M2378	Mucyna (glikozylowane białko tworzące żel) w proszku.
Chlorek potasu	MiliporeSigma	Zobacz materiał P9541 powiedział:	Sól chlorku potasu w postaci stałej.
Jednorazowe mieszadła z PTFE	ThermoFisher Naukowy	14-513-95	Jednorazowe mieszadła magnetyczne.
Taśma teflonowa z uszczelnieniem gwintu PTFE	Firma VWR	470042-938	Taśma teflonowa do wzmacniania połączeń instalacji gazowej.
Wkład oczyszczający Q-Gard 2	MiliporeSigma	QGARD00D2	Wkład oczyszczający do systemu Milli-Q.
Butelki do przechowywania nośników wielokrotnego użytku	ThermoFisher Naukowy	06-423A	Butelki do mieszania i przechowywania pożywek hodowlanych.
Korek gumowy, 30 mm, szary bromobutyl	DWK Nauki Przyrodnicze	224100-331	Gumowe korki do butelek z serum.
Butelka serum z formowaną podziałką, 500 ml	DWK Nauki Przyrodnicze	223952	Szklane butelki na surowicę do szczelnie zamkniętej hodowli.
Zestaw przedłużający mały otwór	Braun Medyczny	471960	Przedłużenie rurki ze złączami typu luer lock.
Chlorek sodu	MiliporeSigma	S3014 powiedział:	Sól chlorku sodu w postaci stałej.
Mieszanina metali śladowych, 1000x	ThermoFisher Naukowy	NC0112668	Skoncentrowany roztwór fizjologicznych metali śladowych.
Uszczelka aluminiowa bez podszewki, 30 mm	DWK Nauki Przyrodnicze	224187-01	Aluminiowe uszczelki zaciskane na gumowych korkach.