Pobranie płynu z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego od modelu myszy zakażonego nietypizowalnym Haemophilus influenzae

Streszczenie

Źródło: Venuprasad, K., et al. Dotchawicze podawanie Haemophilus influenzae w modelach mysich w celu zbadania stanu zapalnego dróg oddechowych. J. Vis. Exp. (2016)

Ten film pokazuje pobieranie i przetwarzanie płynu z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego od myszy poddanej eutanazji zakażonej nietypowalnym Haemophilus influenzae do dalszej analizy.

Protokół

Wszystkie procedury z udziałem modeli zwierzęcych zostały zweryfikowane przez lokalną instytucjonalną komisję ds. opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Kolekcja płynu do płukania oskrzelowo-pęcherzykowego (BALF)
   1. Poświęć mysz przez zwichnięcie szyjki macicy 24 godziny po zakażeniu.
   2. Otwórz jamę brzuszną myszy anatomicznymi nożyczkami, przetnij aortę brzuszną w celu krwawienia i odsłoń brzuszną część płuca.
   3. Odsłoń tchawicę i zaintubuj ją cewnikiem o rozmiarze 20. Wkroplić 0,8 ml buforu BALF (1x PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami), 0,1% dekstrozy, 10 U/ml heparyny) i zebrać płukanie przez delikatne aspiracje. Powtórz tę procedurę trzy razy.
   4. Policz całkowitą liczbę komórek w 100 μl zawiesiny BALF za pomocą hemocytometru pod 10-krotnym powiększeniem z barwieniem błękitem trypanowym.
   5. Przygotuj szkiełka do zmodyfikowanego barwienia Giemsa. Porcjować 100 μl BALF do odpowiednich studzienek cytospiny i odwirować przy 500 x g przez 5 min. Suszyć szkiełka przez 10 minut i barwić komórki modyfikowaną barwierą Giemsa zgodnie z protokołami producenta.
   6. Pozostałe komórki można wykorzystać do późniejszej analizy, takiej jak sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS), mikroskopia konfokalna, ekspresja genów i western blot.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Dekstroza bezwodna	Themo Naukowy	Czynnik R01300
Heparyna	Hospira, Inc	Zobacz materiał RL-3010
Igła strzykawkowa 20/26G	BD	(REF305115/175)
Strzykawka 1 ml	BD	NR KAT. 309602
Cewnik 20GA	BD	NR KAT. 381433
Pęseta #5 Stal nierdzewna, 11cm długości	Hrabstwo Kentscientific	INS600095
5 ml probówki z polistyrenu okrągłodennego	BD	NR KAT. 352058
Probówki do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml	Laboratoria świetlne	A-7001-R
1X PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami)	Gibco (firma Gibco)	10010-023
Bufor do lizy RBC (10X)	Legenda biologiczna	420301