Oczyszczanie w gradiencie gęstości plastoglobul cyjanobakteryjnych

W tym artykule

Streszczenie

Źródło: Shivaiah, K., et al. Izolacja kropelek lipidów plastoglobuli z tkanki liści roślin i cyjanobakterii. J. Vis. Exp. (2022).

Ten film pokazuje izolację plastoglobul od cyjanobakterii za pomocą wirowania w gradicyi gęstości sacharozy, podkreślając ich bogaty w lipidy charakter o niskiej gęstości i zapewniając ich zachowanie strukturalne do dalszej analizy.

Protokół

1. Zbieranie czystych plastoglobul

Przetwarzanie cyjanobakterii
1. Wytwarzać gradient sacharozy w czterech probówkach ultrawirówek o pojemności 2,5 ml ułożonych najpierw warstwami z 500 μl surowych plastoglobul z kroku 1.3 zmieszanych z 750 μl pożywki R 0,7, a następnie nałożyć na 750 μl pożywki R 0,2 (Tabela 1)
2. Odwirować gradient sacharozy przy 150 000 x g przez 90 minut w temperaturze 4 °C. Zebrać czyste plastoglobule (ryc. 1C) za pomocą strzykawki i igły 22 G z górnej fazy gradientu sacharozy i przenieść do probówki o pojemności 1,5 ml.
3. Podaczuj czyste plastoglobule i błyskawicznie zamrażaj w ciekłym azocie. Przechowywać bezpośrednio w temperaturze -80 °C lub liofilizować do postaci suchego proszku.

Tabela 1: Receptury do izolacji plastoglobul z sinic.

Średnie R	50 mM HEPES-KOH (pH 8,0)
Średnie R	5 mM MgCl₂
Średni R 0,2	50 mM HEPES-KOH (pH 8,0)
	5 mM MgCl₂
	0,2 M sacharozy
Średni R 0,7	50 mM HEPES-KOH (pH 8,0)
	5 mM MgCl₂
	0,7 M sacharozy

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Rycina 1: Izolacja i immunoblotting plastoglobulek i tylakoidów. (A) Reprezentatywna oczyszczona próbka plastoglobuli z Z. mays przed ekstrakcją z gradientu sacharozy. (B) Reprezentatywna surowa próbk...