Przygotowanie bakterii Legionella pneumophila do kriogenicznej tomografii elektronowej

Streszczenie

Źródło: Chetrit, D., et al. Zastosowanie obrazowania żywych komórek i tomografii krioelektronowej w celu określenia czasoprzestrzennych cech systemu wydzielania kropk/icm Legionella pneumophila . J. Vis. Exp. (2020)

Film opisuje, jak przygotować próbki Legionella pneumophila do kriotomografii elektronowej poprzez połączenie hodowli bakterii, znakowania nanocząstek złota i technik witryfikacji. Proces ten zachowuje natywne struktury komórkowe i umożliwia obrazowanie w wysokiej rozdzielczości elementów systemu wydzielania związanych z błoną.

Protokół

1. Wykrywanie gęstości masy sfGFP za pomocą Cryo-ET

1. Przygotowanie próbek, zbieranie danych i rekonstrukcja

1. Hodować ciężką plamę Legionella pneumophila wykazującą ekspresję fluorescencyjnie znakowanego białka Dot/Icm na płytkach CYE-agar-streptomycyna przez 48 godzin w temperaturze 37 °C. Ponownie zawiesić komórki w ddH₂O do OD₆₀₀ 0,7. Dodać 5 μl koloidalnych cząstek złota (BSA Tracer, 10 nm) do 20 μl zawiesiny komórek.

2. Odpipetować 5 μl mieszaniny komórek na świeżo rozżarzoną, dziurawą siatkę węglową (R 2/1 na oczkach Cu 200) i odstawić na 1 minutę. Osuszyć bibułą filtracyjną i zamrozić w ciekłym etanie za pomocą tłoka napędzanego grawitacyjnie.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Cząstki złota koloidalnego 10 nm	Aurion powiedział:	25486
100x cel Plan Apo (1.4 NA)	Nikon
ASY	Sigma-Aldrich	Numer katalogowy A9758
Cyfrowy aparat monochromatyczny CoolSNAP EZ 20 MHz	Fotometria
Ramka genowa, 1,7x2,8 cm, 125 μL	Fisher Naukowy	AB-0578 powiedział:
Siatka Holey Carbon R 2/1 Cu 200 mesh	Quantifoil (Olej ilościowy)	Q225-CR1 powiedział:
Azotan żelaza(III) niewodny	Sigma-Aldrich	216828
Kamera K2 Summit do krio-EM	GATAN
Szkiełka podstawowe do mikroskopu 22x22 mm	Fisher Naukowy	12-542B
Szkiełka podstawowe do mikroskopu 24x50 mm	Fisher Naukowy	12-545 tys.
Szkiełka mikroskopowe 25x75x1 mm	Globus Naukowy	1380
Książka do slajdów 6.0	Innowacje w zakresie inteligentnego obrazowania
Lekki silnik Spectra X	Lumencor