Przygotowanie surowego ekstraktu komórkowego z Vibrio natriegens

Streszczenie

Źródło: Wiegand, D. J., et al. Ekspresja białek bezkomórkowych przy użyciu szybko rosnącej bakterii Vibrio natriegens. J. Vis. Exp. (2019).

Ten film pokazuje przygotowanie ekstraktu komórkowego z Vibrio natriegens, szybko rosnącej bakterii znanej z wysokiej szybkości syntezy białek. Osad bakteryjny jest myty i ponownie zawieszany w buforze do lizy przed sonikacją na lodzie, aby zapobiec degradacji komórek. Lizat jest odwirowywany w celu oddzielenia nierozpuszczalnych szczątków komórkowych, a ekstrakt komórkowy jest zbierany, zamrażany i przechowywany do wykorzystania w przyszłości.

Protokół

1. Przygotowanie surowych ekstraktów komórkowych V. natriegens – kultura bakteryjna

1. Przygotować pożywkę do wzrostu bakterii V. natriegens , bulion lizogeniczny wersja 2 (LB-V2) zgodnie z tabelą 1. Wysterylizuj pożywkę wzrostową przez autoklawowanie. Poczekaj, aż nośnik osiągnie temperaturę pokojową (RT). Przechowuj nadmiar nośników w RT.
   OSTROŻNOŚĆ: Nosić odpowiednie środki ochrony osobistej (PPE) i zapoznać się z instrukcjami obowiązującymi w laboratorium podczas obsługi autoklawu.
2. Użyj glicerolu z V. natriegens typu dzikiego, aby zaszczepić 3 ml pożywki LB-V2. Rosnąć przez noc w temperaturze 30 °C, wstrząsając z prędkością 225 obr./min.
3. Przemyć 1 ml nocnej kultury przez odwirowanie przy 10 600 x g na wirówce stołowej przez 1 minutę. Odessać supernatant bez naruszania powstałego osadu i ponownie zawiesić w 1 ml świeżej pożywki LB-V2.
4. Do autoklawizowanej 4-litrowej kolby Erlenmeyera z przegrodą i sterylną pokrywą dodać 1 l świeżej pożywki wzrostowej LB-V2. Zaszczepić przy użyciu 1 ml przemytej kultury przez noc (stosunek rozcieńczenia 1:1,000). Uprawiaj kulturę w temperaturze 30 °C, wytrząsając z prędkością 225 obr./min.
   UWAGA: Kultury V. natriegens można skalować w górę lub w dół, zachowując stosunek rozcieńczenia 1:1,000. Na przykład, dodać 250 μl przemytej kultury przez noc do 250 ml świeżej pożywki wzrostowej LB-V2 w 2-litrowej kolbie Erlenmeyera z przegrodą o pojemności 2 litrów ze sterylną pokrywą.
5. Monitorować OD₆₀₀ w kulturze za pomocą spektrofotometru. Gdy kultura osiągnie OD₆₀₀ = 1,0 ± 0,2, zbieraj kulturę przez odwirowanie w temperaturze 3 500 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Umieść granulat na lodzie.
   UWAGA: V. natriegens rośnie szybko, dlatego konieczne jest ścisłe monitorowanie kultury. Wzrost do OD₆₀₀ = 1,0 powinien zająć około 1,5-2 h przy stosunku rozcieńczenia 1:1,000.
6. Odessać supernatant i natychmiast przechowywać powstały osad bakteryjny w temperaturze -80 °C lub bezpośrednio przejść do lizy komórek opisanej w sekcji 2.
   NUTA: Ten krok jest dobrym punktem zatrzymania; Zaleca się jednak, aby pelety zostały przetworzone natychmiast lub w ciągu 1-2 dni, aby uzyskać najlepsze wyniki.

2. Przygotowanie surowych ekstraktów komórkowych V. natriegens – liza komórek

1. Przygotować bufor do lizy S30 zgodnie z tabelą 1 w sterylnej wodzie dejonizowanej (DI) i dostosować pH do 7,7 za pomocą lodowatego kwasu octowego.
   OSTROŻNOŚĆ: Z lodowatym kwasem octowym należy obchodzić się przy użyciu odpowiednich środków ochrony osobistej podczas regulacji pH.
2. Schłodzić bufor do lizy S30 do około 4 °C w lodówce lub na lodzie przed rozpoczęciem procedury lizy komórek.
   NUTA: W celu szybkiego schłodzenia bufor do lizy można umieścić w temperaturze -20 °C. Nie pozwól, aby bufor zamarł.
3. Umieść granulki komórkowe na lodzie na 10-20 minut lub do całkowitego rozmrożenia. Ponownie zawiesić wszystkie osady powstałe z tej samej 1 l kultury za pomocą 10 ml zimnego buforu do lizy S30, a następnie przenieść zawiesinę do probówki o pojemności 50 ml. Jeżeli granulki nie zostaną zamrożone w zamrażarce w temperaturze -80 °C w kroku 1.6, należy przejść bezpośrednio do ponownego zamieszania.
   NUTA: Zwiększ objętość buforu do lizy S30 używanego do początkowego ponownego zawieszania granulek w razie potrzeby.
4. Odwirować zawiesinę o sile 3 500 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Odessać supernatant bez naruszania osadu. Umyj osad po raz drugi za pomocą 10 ml zimnego buforu do lizy S30. Umieść granulkę na lodzie.
5. W chłodni dodaj 500 μl zimnego buforu do lizy S30 do osadu w probówce o pojemności 50 ml. Za pomocą końcówki do pipet o szerokim otworze ponownie zawiesić osad i ostrożnie przenieść całą zawiesinę granulek do probówki o pojemności 2 ml.
   NUTA: Jeśli pipeta o szerokim otworze nie jest dostępna, użyj nożyczek, aby odciąć koniec końcówki pipety o pojemności 1 ml, aby zwiększyć otwór do przenoszenia granulek.
   1. Przenieś jak najwięcej pelletu, nie zwiększając znacznie objętości; jednak osad powinien być ponownie zawieszony w wystarczającej ilości cieczy, aby mógł być poddany sonikacji, na co wskazuje jednorodna zawiesina w probówce o pojemności 2 ml. Nie przepełniaj probówki o pojemności 2 ml. Zawiesina nie powinna przekraczać 1,5 ml; W razie potrzeby podziel na wiele rurek.
6. Trzymaj osad komórkowy na lodzie i pracuj w chłodni. Napełnij zlewkę o pojemności 600 ml lodem i umieść na niej uchwyt na probówkę o pojemności 2 ml.
   NUTA: Pomocne jest umieszczenie uchwytu probówki blisko boku zlewki, tak aby zawiesina granulek była widoczna w lodzie w celu monitorowania postępu sonikacji (patrz rysunek 1).
7. Zawiesić na krótko zawiesiny w probówce o pojemności 2 ml w celu homogenizacji komórek, przesunąć probówki, aby usunąć wszelkie komórki na dnie nasadki i umieścić w uchwycie probówki z otwartą nasadką. Opuść końcówkę sonikatora do zawiesiny tak, aby znajdowała się tuż pod powierzchnią cieczy.
8. Przygotuj zestaw do sonikacji, jak pokazano na rysunku 2 , używając sonikatora i sondy o średnicy końcówki 1/8 cala. Wprowadź następujące ustawienia do sterownika sonikatora: częstotliwość 20 kHz i amplituda 50%, czas włączenia impulsu: 10 s, czas wyłączenia impulsu: 60 s.
9. Uruchom protokół sonizacji impulsowej przez trzy cykle. Jeżeli całkowita objętość zawiesiny granulek wynosi > 500 μl, należy uruchomić protokół sonizacji impulsowej sześć razy.
   NUTA: Ogólnie rzecz biorąc, 3-6 impulsów jest wystarczających do lizy osadów V. natriegens ; W zależności od sonikatora mogą być wymagane dodatkowe impulsy. Podczas sonikacji użyj platformy pokrętła regulacyjnego, aby przesunąć sondę w górę iw dół, aby zlizować wszelkie osady, które mogły osiąść na dnie rurki. Rurkę można wyjąć z uchwytu i na krótko zawirować w celu ponownej homogenizacji zawiesiny między impulsami.
   OSTROŻNOŚĆ: Nosić odpowiednią ochronę słuchu, gdy sonikator jest aktywny.
10. Po sonikacji odwirować surowy ekstrakt komórkowy w temperaturze 16 000 x g przez 30-45 minut w temperaturze 4 °C lub do momentu, gdy lizat będzie wolny od jakichkolwiek zanieczyszczeń komórkowych, jak pokazano na rysunku 3.
11. W chłodni należy przelać 50 μl powstałych supernatantów do nowych probówek o pojemności 2 ml bez naruszania osadu.
    NUTA: Wszelkie zanieczyszczenia, które zostaną przypadkowo przeniesione do nowych probówek o pojemności 2 ml, drastycznie zmniejszą zdolność ekstraktu do wysokowydajnej syntezy białek.
12. Błyskawiczne zamrażanie surowych ekstraktów komórkowych poprzez umieszczenie probówek w uchwycie probówki z dołączonym sznurkiem do zanurzania, jak pokazano na rysunku 4. Zanurz probówki w Dewarze zawierającym ciekły azot i natychmiast umieść je w zamrażarce w temperaturze -80 °C do czasu użycia. OSTROŻNOŚĆ: Używaj odpowiednich środków ochrony osobistej do pracy z ciekłym azotem, w tym fartucha laboratoryjnego, okularów ochronnych, osłony twarzy, fartucha kriogenicznego i rękawic.

Tabela 1: Odczynniki do przygotowania 1 l bakteryjnej pożywki do hodowli LB-V2 i 0,5 l buforu do lizy komórek S30A.

Tabela 1 A	Przygotowanie pożywki do hodowli bakterii LB-V2
Składnik	Ilość (g)	Stężenie końcowe (mM)	Objętość końcowa (L)
Rosół LB (młynarz)	25		1
Zawartość NaCl	11.69	200
MgCl2	2.20	23.1
Kcl	0.31	4.2
Tabela 1 B	Przygotowanie buforu do lizy S30A
Składnik	Ilość (g)	Stężenie końcowe (mM)	Objętość końcowa (L)
Roztwór Tris (pH 8,0) - 1 M (ml)*	25	50	0.5
Mg-glutaminian	2.72	14
K-glutaminian	6.10	60
Ditionitreitol (DTT) - 1 M (ml)*	1	2

Wyniki

Rysunek 1: Zbliżenie na zlewkę i uchwyt probówki na platformie sonizacyjnej.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Probówki 15 ml	Corning	352196
Probówki 2 ml	Eppendorf powiedział:	22363352
Probówki 50 ml	Corning	352070
Kolba Dewara - 4L	ThermoScientific (Nauka)	10-194-100C
Tetrahydrat soli hemimagnezowej kwasu L-glutaminowego	Sigma	49605
Kwas L-glutaminowy sól potasowa jednowodna	Sigma	Zobacz materiał G1149
Rosół LB (młynarz)	Sigma	L3522
Chlorek magnezu (MgCl₂)	Sigma	Zobacz materiał M8266
Chlorek potasu (KCl)	Sigma	Zobacz materiał P9333 powiedział:
Granulki wodorotlenku potasu	Sigma/Roche	1050121000
Sonikator Q125 i sonda CL-18	Qsonica powiedział:	4422
Chlorek sodu (NaCl)	Sigma	Zobacz materiał S7653
Vibrio natriegens (typ dziki) Liofilizowany materiał	Kontroler ATCC (Kontroler T	14048