Generowanie bakterialnych nanocelulozowych pelikuli osadzonych w magnetycie

Streszczenie

Źródło: Arias, S. L. i in. Wytwarzanie funkcjonalizowanej magnetycznej nanocelulozy bakteryjnej z nanocząstek tlenku żelaza. J. Vis. Exp. (2016)

Ten film demonstruje syntezę nanocząsteczek magnetytu in situ w bakteryjnej nanocelulozowej pelikule produkowanej przez Gluconacetobacter xylinus. Wyjaśnia, jak magnetyczna nanoceluloza bakteryjna powstaje poprzez infuzję jonów żelaza, wytrącanie alkaliczne oraz oczyszczanie.

Protokół

1. Synteza nanocząstek tlenku żelaza powlekanych polimerami i ich osadzanie w bakteryjnej błonie nanocelulozy (BNC)

1. Wypchnij 1000 ml wody o wysokiej czystości z gazem azotowym, aby usunąć rozpuszczony tlen z wody i zastąpić go azotem.
2. Użyj kolby z trzema szyjkami i okrągłym dnem do przygotowania roztworu w stosunku molarnym 2:1 chlorku żelaza (III) heksahydratu (FeCl_{3,6H 2O}) oraz chlorku żelaza (II) rozcieńczonego wodą o wysokiej czystości odtlenionej. Na przykład użyj 5,4 g FeCl_{3,6H 2}O oraz 1,98 g FeCl 2,4H₂O w 10 ml wody o wysokiej czystości odtlenionej. Jeśli preparat ten stanie się zbyt lepki i trudny do mieszania, użyj 0,54 g FeCl 3,6H ₂O oraz 0,198 g FeCl 2,4H₂O w 20 ml wody o wysokiej czystości odtlenionej.
   NUTA: Skróć czas ekspozycji FeCl 2,4H _2Ona powietrze, ważąc ten związek chemiczny tak szybko, jak to możliwe. Po wprowadzeniu do kolby z trzema szyjkami okrągłego dna, należy zamknąć kolbę z trzema gryfkami okrągłym dnem korkami przegrody, aż zostanie połączona z dopływem gazu azotowego i rurką skraplacza.
3. Użyj dwóch szyjków zbiornika, aby zapewnić stały dopływ i wypływ azotu, łącząc dopływ azotu z igłą wbitą w septum i przymocowaną do szyjki naczynia.
4. Umieść 1 pellicle BNC (średnica 15,6 mm i grubość 2-3 mm) w naczyniu wraz z reagentami. Upewnij się, że próbka jest całkowicie zanurzona w cieczy.
5. Połączyć pozostałą szyjkę naczynia z rurą skraplaczącą. Dodatkowo użyj rurki do suszenia wypełnionej bezwodnym siarczanem wapnia na wierzchu rurki skraplacza. Przepuszczaj wodę przez rurkę skraplacza.
6. Uszczelnij wszystkie połączenia szkła smarem próżniowym.
7. Podgrzej roztwór w kąpieli olejowej silikonowej do 80 °C za pomocą mieszanej płyty grzewczej, utrzymując tę temperaturę do kroku 1,10. Użyj małego magnetycznego batonika mieszającego, aby mieszać reagenty z prędkością 350 obr./min przez 5 minut. Upewnij się, że BNC jest odpowiednio nasączone roztworem żelaza, a reagenty są całkowicie rozpuszczone. Mieszaj mieszankę aż do końca eksperymentu.
   NUTA: Użyj termometru, aby sprawdzić temperaturę oleju silikonowego. Powinna być stabilna do 80 °C.
8. Zwiększ prędkość mieszania do 700 obr./min i dodaj (przez upuszczenie) w odstępie 5 minut 5 ml wodorotlenku amonu (NH₄OH, 14%) do 10 ml roztworu żelaza za pomocą igły pipetującej, która została również wbita w korek przegrody. Po dodaniu wodorotlenku amonu kolor roztworu zmienia się z żółto-pomarańczowego na.
9. Kontynuuj mieszanie roztworu w temperaturze 80 °C przez kolejne 5 minut. Unikaj mieszania o dużej prędkości, aby zachować integralność próbki. Wysokie prędkości, czyli powyżej 1000 obr./min, mogą zniszczyć próbkę.
10. Obniż temperaturę roztworu do 30 °C, używając dolnej części płyty grzewczej do mieszania i mieszaj przez kolejne 5 minut. Następnie wyłącz płytę grzewczą. W tym momencie nanocząstki tlenku żelaza (IONP) zostały włączone do siatki BNC.
11. Schłodzić mieszaninę do temperatury pokojowej (RT) i oddzielić magnetyczne nanocząstki (MNP) i BNC za pomocą silnego magnesu trwałego (np. 1 Tesla). Aby to zrobić, przelej mieszaninę do kolby naczyniowej, a następnie, trzymając magnes blisko naczynia, trzymaj MNP i BNC na miejscu podczas przelewania supernatantu.
    Nuta: Uważaj przy obsłudze silnych magnesów, ponieważ mogą być szkodliwe przy nieprawidłowym użyciu. W etapach (1.12) - (1.14) i (1.16) użyj odtlenionej wody o wysokiej czystości przygotowanej wcześniej w (1.1), aby zapobiec utlenianiu cząstek.
12. Ponownie zawiesij MNP i BNC w 100 ml wody. Delikatnie potrząśnij roztworem, aby usunąć wszystkie MNP, które nie są silnie włączone do BNC. Ponownie przelej supernatant, trzymając MNP i BNC na miejscu za pomocą magnesu.
13. Przemyj MNP i BNC kilka razy wodą, aż supernatant osiągnie neutralne pH (pH~7), mierzone kolorymetrycznym paskiem.
14. Oddziel magnetycznie funkcjonalizowaną BNC lub magnetyczną nanocelulozę bakteryjną (MBNC) od MNP za pomocą pęsety i przepłucz MBNC kilkakrotnie wodą, aż woda stanie się czysta.
15. Sterylizuj MBNC, wystawiając MBNC na działanie UV (110-280 nm).
16. Autoklawem podłącz 500 ml odtlenionej wody o wysokiej czystości w temperaturze 120 °C na 20 minut i przechowuj MBNC w 20 ml tej wody.
17. Aseptycznie zanurz próbkę w 1% glikolu polietylenowego (PEG) i mieszaj przez 2 godziny w temperaturze RT (37 °C). Procedura ta poprawia biokompatybilność i stabilność nanocząsteczek tlenku żelaza zdeponowanych w BNC, szczególnie tych wystawionych na powierzchnię. Powłoka PEG będzie dystrybuowana w sieci MBNC 3D.
    NUTA: Nagie IONP łatwo ulegają utlenianiu w powietrzu ze względu na wysoką aktywność chemiczną. Chociaż PEG jest uważany za materiał niebiodegradowalny, jego stabilność chemiczna zależy od zastosowanych warunków biologicznych, takich jak zawartość wody, pH, temperatura, obecność enzymów, reaktywnych form tlenu, reaktywnych odmian azotu i innych.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Glucoacetobacter xylinus	ATCC	700178
Chlorek żelaza(III) Heksahydrat	Sigma Aldrich	236489-100G
Wodorotlenek amonu	Macron Fine Chemicals	6665-46
Poli (glikol etylenowy), średnia Mn 400	Sigma Aldrich	202398-250G
Chlorek żelaza (II)	Sigma Aldrich	44939-250G
Bezwodny siarczan wapnia	Dreżyt W.A. Hammonda	13001
Smar o wysokiej próżni	Sigma Aldrich	Z273554-1EA
Paski testowe pH	Sigma Aldrich	P4786-100EA
Kolba destylacyjna typu destylującego z okrągłym dnem i trzema kątami szyjki	Sigma-Aldrich	CLS4965250
Olej silikonowy do kąpieli olejowych	Sigma-Aldrich	85409-250ML
Rurka susząca	Chemglass	CG-1295-01
Stoper przegrody, typ rękawa	Chemglass	CG-3022-98
Magnetyczny pręt mieszający	Chemglass	CG-2001-05
Kondensator	Chemglass	CG-1218-01
Regulator temperatury	BriskHeat	SDC120JC-A
Płyta grzewająca mieszająca	Fisher Scientific	11-100-49SH