Przygotowanie płytki mikrofluidycznej z komórkami bakteryjnymi

Streszczenie

Źródło: Sutlief, A. L. i in. Analiza naprężeń ścinających na żywych komórkach na Pseudomonas aeruginosa z wykorzystaniem zautomatyzowanego systemu mikrofluidycznego o wyższej przepustowości. J. Vis. Exp. (2019).

Ten film prezentuje przygotowanie płytki mikrofluidycznej do badań naprężeń ścinających w kulturach bakteryjnych. Po przygotowaniu kanałów podłożem, komórki bakteryjne są wprowadzane do kanału eksperymentalnego i inkubowane do przyczepienia. Pozostałe nośniki i hodowla są usuwane, aby przygotować system do kolejnych eksperymentów z naprężeniami ścinającymi.

Protokół

1. Przygotowanie medialne

1. Przygotuj minimalne medium (MM) z 0,25% glukozy. Aby uzyskać 1 L MM z 0,25% glukozy, dodaj 200 mL bezpłodnego roztworu soli M9, 2 mL bezpłodnego 1 M siarczanu magnezu (MgSO₄), 100 μL sterylnego 1 M chlorku wapnia (CaCl₂) oraz 12,5 mL bezpłodnej 20% glukozy (w/v) do wody (dH₂O) przy końcowej objętości 1 L.
2. Wymagane medium przeniesiono do sterylnej butelki za pomocą technik sterylnych. Przygotuj wymaganą ilość w zależności od liczby wykorzystywanych kanałów. Zazwyczaj każdy kanał wymaga 200 μL na zasiew, 300 μL na zasiew, a 1300 μL na eksperyment 24-godzinny.
3. Umieść butelkę w inkubatorze lub kąpieli wodnej ustawionej na temperaturę eksperymentalną. Medium powinno mieć temperaturę eksperymentalną przed użyciem, aby zapobiec powstawaniu pęcherzyków w mikrokanałach.

2. Przygotowanie nocnej i eksperymentalnej hodowli szczepu Pseudomonas aeruginosa PA01, który wyraża wzmocnione zielone fluorescencyjne białko (PA01-EGFP).

1. Włóż 15 mL eksperymentalnego medium do sterylnej kolby bocznej i zaszczep jedną lub dwie kolonie z płytki agarowej z nałożeniem PA01-EGFP. Rozwiń hodowlę na 12-16 godzin na stole inkubatorowym/shakerowym w temperaturze 37 °C i 180-220 obr./min.
2. Zmierz OD₆₀₀ kultury nocnej. Gdy OD₆₀₀ przekroczy 0,80, rozcieńcz nocną hodowlę do końcowego OD 0,8 przy użyciu świeżego MM. Umieść eksperymentalną hodowlę w inkubatorze lub kąpieli wodnej w temperaturze 37 °C, aż będzie potrzebna do zasiewania kanałów mikrofluidycznych. Sprawdź ponownie OD₆₀₀ tuż przed seedowaniem, aby upewnić się, że nie zmienił się znacząco względem docelowego OD₆₀₀, czyli 0,8 w tym przypadku.

3. Uruchomienie sprzętu

1. Ustaw stację systemową zgodnie z instrukcjami użytkownika, podobnie jak na Rysunku 1. Aby uniknąć błędu w połączeniu instrumentu z oprogramowaniem, włącz instrument w następującej kolejności:
   PC Workstation
   Moduł fluorescencji. Upewnij się, że migawka fluorescencyjna jest WŁĄCZONA (niebieskie światło przy przycisku migawki włączone)
   Kontrolery sprzętowe
   Kontroler systemu obrazowania (patrz Tabela materiałów)
   Kamera CCD
   Stacja obrazowania (mikroskop)
   UWAGA: Temperatura podgrzanej płyty powinna być dostosowana do pożądanej temperatury eksperymentalnej.
2. Rozpocznij aplikację kontrolną i wpisz numer tablicy umieszczony na etykiecie po boku tablicy.
   UWAGA: Po uruchomieniu aplikacji sterującej pojawią się dwa oddzielne okna aplikacji: jedno dla oprogramowania sterującego mikroskopem/oprogramowaniem obrazującym oraz drugie dla modułu sterującego pompą i interfejsem płyty studniowej.

4. Gruntowanie i zasiewanie płytki mikrofluidycznej

UWAGA: Gruntowanie, zasiew, przyczepienie i wzrost bakterii są zilustrowane na Rysunku 2.

1. Wyjmij 48-dołkowy mikrofluidowy płytkę z opakowania, uważając, by nie dotykać powierzchni szkła na dnie płyty. Oczyść szkiełko na dole płytki chusteczką do soczewek, ściereczką bez kłaczków lub chusteczką o niskiej ilości kłaczków.
2. Aby zaparować kanały mikrofluidyczne, pipetować 200 μL o temperaturze 37 °C MM do otworu wyjściowego, uważając, aby uniknąć powstawania pęcherzyków. Umieść płytę w etapie płytowym i przetrzyj ją etanolem, pozwalając jej wyschnąć, a następnie zabezpiecz ją na etapie płytowym.
3. W trybie manualnym na module sterującym ustaw Fluid jako
   luria-bertani (LB) przy 37 °C oraz Max Sgain przy 5,00 dyne/^{cm 2}. Kliknij na otwory wyjściowe, aby aktywować przepływ z wyjścia do wejścia, przygotowując kanały. Po 5-minutowym zacieńczeniu wstrzymaj przepływ, aby przygotować się do siewu. Ostrożnie usuń płytkę ze sceny i pipetuj pozostałe media od wyjścia, ale nie usuwaj żadnego medium z wewnętrznego okręgu prowadzącego do kanałów mikrofluidycznych.
4. Aby zasiać kanały eksperymentalne, najpierw pipetuję 300 μL MM do studni wejściowej, a następnie pipetujesz 300 μL hodowli bakteryjnej do studni wyjściowej do studni wyjściowej. Umieść płytkę z powrotem w etapie płyty, upewniając się, że przed położeniem jej na niej wytrzyłeś interfejs.
5. W module sterującym skup się na jednym kanale za pomocą transmisji z kamery na żywo po umieszczeniu stołu płytowego na stopniu mikroskopu. Podczas wizualnego monitorowania za pomocą transmisji na żywo, wznowić przepływ w temperaturze 1,00-2,00 dyne/^cm2 przez około 2-4 sekundy, aby umożliwić komórkom wejście do kanału eksperymentalnego, ale nie w kanałach serpentynowatych. Zostaw płytkę na stopniu z kontrolowaną temperaturą przez 1 godzinę, aby umożliwić przyczepienie komórek. Podczas 1-godzinnej inkubacji można skonfigurować moduł sterujący oraz oprogramowanie montażowe dla autoruna.
   UWAGA: Czas potrzebny na wysiew będzie się różnił w zależności od podłoża i organizmu, dlatego powinien być uważnie monitorowany przez feed na żywo aż do optymalizacji i wykorzystania jako ogólny przedział czasowy. Siewowanie na całej płycie może się różnić, co wymaga więcej czasu, by przystosowany przepływ do niektórych kolumn kanałów mógł umożliwić pełne siewienie.
6. Po okresie przyczepienia delikatnie usuń płytkę ze sceny i najpierw podłącz bakterie od wypływu, unikając zakłócania kanału. Przy użyciu nowej końcówki pipety usuń medium z wejścia.

Wyniki

Rysunek 1: Poszczególne elementy układu mikrofluidycznego. Poszczególne elementy są wymienione od lewej do prawej: 1. Kamera CCD, 2. Mikroskop odwrócony o wysokiej rozdzielczości z automatycznym stopniem, automatycznym modułem fluorescencji...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Chlorek amonu, ACS	VWR	BDH9208-500G	Część kompozycji minimalnego medium
BioFlux 1000 48 dołków płytka o niskim ścinaniu	Fluxion Biosciences	910-0047
System obrazowania mikrofluidycznego BioFlux 1000Z	Fluxion Biosciences	BF 1000Z
Diwodnik chlorku wapnia, klasa ACD	VWR	97061-904	Część kompozycji minimalnego medium
Dekstroza, bezwoda, ACS	VWR	BDH9230-500G	Część kompozycji minimalnego medium
Siarczan magnezu ACS klasy	VWR	EM-MX0070-1	Część kompozycji minimalnego medium
Fosforan potasu, monozasadowy, klasa ACS	VWR	BDH9268-500G	Część kompozycji minimalnego medium
Pseudomonas Aeurginosa GFP	ATCC	15692GFP	W tym badaniu użyto szczepu bakterii Pseudomonas aeurinosa PA01 z modyfikacją GFP.
Chlorek sodu, ACS	VWR	BDH9286-500G	Część kompozycji minimalnego medium
Fosforan sodu, monozasadowy, bezwodnisty, odczynnikowy	VWR	97061-942	Część kompozycji minimalnego medium