Ekstrakcja bakterii apoplastycznych za pomocą metody ciśnieniowej opartej na strzykawkach

Streszczenie

Źródło: Rufián, J. S. i in., Analiza pojedynczych komórek ekspresji genów Pseudomonas Syringae w tkance roślinnej. J. Vis. Exp. (2022)

Ten film demonstruje metodę ciśnienia opartą na strzykawkach do ekstrakcji bakterii apoplastycznych, które rozmnażają się i tworzą mikrokolonie w apoplastyce, czyli przestrzeni międzykomórkowej między komórkami roślinnymi. Metoda ta daje próbki bakteryjne wolne od zanieczynków odpowiednie do analizy pojedynczych komórek w dalszej fazie.

Protokół

Ekstrakcja bakterii z apoplastu

1. Cztery dni po szczepieniu odetnij albo część powietrzną rośliny Arabidopsis , albo zaszczepiony liść fasoli i umieść go w strzykawce 20 mL bez igły (rysunek 2G). W przypadku liści fasoli zwij liść na siebie, pozostawiając powierzchnię auksialną na zewnątrz, jak pokazano na Rysunku 2F.
2. Dodaj tyle wody destylowanej, aby pokryć tkankę (zwykle 10-15 mL).
3. Włóż tłok i z strzykawką ustawioną pionowo, z końcówką skierowaną do góry, usuń nadmiar powietrza i pęcherzyków powietrza z wnętrza strzykawki, delikatnie stukając w lufę, aż całe powietrze zbliży się do końcówki. Przesuń tłok, żeby wypuścić powietrze. Gdy w środku jest jak najmniej powietrza, przykryj jej czubek folią parafinową.
4. Ostrożnie naciśnij tłok, aby wygenerować dodatnie ciśnienie, aż tkanka stanie się ciemniejsza (Rysunek 1I i Rysunek 2H). Następnie pociągnij tłok, aby wygenerować ujemne ciśnienie (Rysunek 1J i Rysunek 2I). Powtórz ten krok 3-5 razy.
5. Usuń folię parafinową i tłok i zbierz płyn zawierający bakterie ekstrakcyjne z apoplastu, jak na rysunku 2J.

Wyniki

Rysunek 1: Szczepienie bakteryjne i ekstrakcja apoplastów z użyciem roślin Arabidopsis. (A) Przygotowanie doniczki z prawidłowo przymocowaną metalową siatką. (B) S...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Strzykawka 20 mL			Brak specjalnych wymagań
Stożkowe lampy o pojemności 50 mL	Sarstedt
Parafilm	Plastikowe opakowania Pechiney
Pęseta			Brak specjalnych wymagań
Komora próżniowa o średnicy 25 cm	Kartell	554
Pompa próżniowa	GAST	DOA-P504-BN