Wykrywanie patogenów ryb za pomocą analizy powtarzania tandemowego o zmiennej liczbie (VNTR)

Streszczenie

Źródło: Gulla, S. i inni. Wielolokusowa analiza powtórzeń o zmiennej liczbie dla bakterii patogennej ryb Yersinia ruckeri za pomocą multiplex PCR i kapilarnej elektroforezy. J. Vis. Exp. (2019).

Ten film pokazuje procedurę rozdzielania fluorescencyjnie znakowanych amplikonów o zmiennej liczbie powtórzeń tandemowych (VNTR), pochodzących z bakterii patogennej ryb, przy użyciu elektroforezy kapilarnej do generowania profili elektroferograficznych specyficznych dla rozmiaru do identyfikacji bakterii.

Protokół

1. Ustawianie i warunki działania elektroforezy kapilarnej

1. Po potwierdzeniu amplikonów PCR (reakcja łańcuchowa polimerazy), rozcieńczaj produkty PCR w stosunku 1:10 (v/v) w oczyszczonej wodzie. Zamknąć, wymieszać i krótko wirować.
2. Pracując w spalince, przygotuj objętość mieszanki głównej składającej się z 9 μL formamidu i 0,5 μL standardowego rozmiaru na produkt PCR (pozwalając na 10% nadwyżki objętości). Krótko rozprowadź i rozprowadz 9,5 μL do dołków na płytce odpowiedniej dla dostępnego systemu CE (elektroforeza kapilarna), po czym dodasz 0,5 μL rozcieńczonego produktu PCR. Zamknąć, wymieszać i krótko wirować.
   OSTROŻNOŚĆ: Obchodz się z nią ostrożnie. Mieszanie formamidu z wodą generuje kwas mrówkowy, który jest toksyczny.
3. Za pomocą cyklera termicznego PCR denaturuj próbki w temperaturze 95 °C przez 3 minuty, po czym chłodzą się do 4 °C na czas nieokreślony. Krótko wiruj i załaduj płytę na skalibrowany system CE zgodnie z instrukcjami producenta.
4. Wykonaj analizę fragmentów CE z użyciem odczynników odpowiednich dla wybranego urządzenia i następujących ustawień: 60 °C; Zastrzyki 5 s przy napięciu 1,6 kV (32 V na cm); 32 minuty pracy przy napięciu 15 kV (300 V na cm). Analiza fragmentów CE 24 dołków na 24-naczyniowej kapilarze (50 cm) zazwyczaj zajmuje około 50 minut.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Analizator genetyczny Avant 3500xL	Thermo Fisher Scientific	A30469	Wykorzystywane do analizy fragmentów elektroforezy kapilarnej.
Moduły BioNumerics7	Matematyka stosowana	NIE	Używany do generowania minimalnych drzew rozpiętych na podstawie danych MLVA.
Wirówka	Jak preferowane.	NIE
Elektrony Eppendorf Safe-Lock, 1,5 mL	Eppendorf	30120086	Rurki wirówkowe używane podczas ekstrakcji DNA.
Zamrażarka	Jak preferowane.	NIE
Szafka na spaliny	Jak preferowane.	NIE
GeneMapper Software 5	Thermo Fisher Scientific	4475073	Używany do odczytu elektroferogramów z elektroforezy kapilarnej.
GeneScan 600 LIZ Size, rozmiar barwnika Standard v2.0	Thermo Fisher Scientific	4408399	Standard rozmiaru stosowany podczas elektroforezy kapilarnej.
Hi-Di formamid	Thermo Fisher Scientific	4311320/4440753	Dejonizowany formamid stosowany podczas elektroforezy kapilarnej. Przygotujcie pracujących aliquoutów.
Woda Milli-Q	NIE	NIE	Woda oczyszczona używana podczas PCR i kapilarnej elektroforezy. Standardowy przepis; produkowanym wewnętrznie.
Zestaw multipleksowy PCR Plus	Qiagen	206151/206152
Cykler termiczny PCR	Jak preferowane.	NIE
Polimer POP-7 dla analizatorów genetycznych 3500 Dx/3500xL Dx	Thermo Fisher Scientific	A26077/4393713/4393709	Matryca separacyjna stosowana podczas elektroforezy kapilarnej.
Czysta kultura Yersinia ruckeri	NIE	NIE	Np. krioprezerwacja lub świeżość.
Woda wolna od RNaz	Qiagen	NIE	W: Zestaw multipleksowy PCR Plus
Bufor Tris-borian-EDTA (TBE)	NIE	NIE	Standardowy przepis; produkowanym wewnętrznie.
Trypsyna sojowa agar/agar z krwią bydła	NIE	NIE	Standardowy przepis; produkowanym wewnętrznie.
Vortexer	Jak preferowane.	NIE