Ilościowy pomiar translokacji GLUT4 do błony komórkowej przy użyciu cytometrii przepływowej

Podsumowanie

Niniejszy protokół opisuje szybką technikę ilościowego oznaczania translokacji GLUT4 z cytoplazmy do błony plazmatycznej komórek za pomocą cytometrii przepływowej.

Streszczenie

Glukoza jest głównym źródłem energii dla organizmu, co wymaga stałej regulacji jej stężenia we krwi. Wydzielanie insuliny przez trzustkę indukuje pobór glukozy przez tkanki wrażliwe na insulinę, przede wszystkim przez mózg, mięśnie szkieletowe i adipocyty. Pacjenci cierpiący na cukrzycę typu 2 i/lub otyzację często rozwijają insulinooporność i nie są w stanie kontrolować homeostazy glukozy. Nowe spostrzeżenia dotyczące mechanizmów insulinooporności mogą dostarczyć nowych strategii leczenia cukrzycy typu 2.

Rodzina transporterów glukozy GLUT składa się z trzynastu członków rozmieszczonych w różnych tkankach w całym organizmie¹. Transporter glukozy typu 4 (GLUT4) jest głównym transporterem pośredniczącym w pobieraniu glukozy przez tkanki wrażliwe na insulinę, takie jak mięśnie szkieletowe. Po związaniu insuliny z jej receptorem pęcherzyki zawierające GLUT4 przemieszczają się z cytoplazmy do błony komórkowej, indukując pobieranie glukozy. Zmniejszona translokacja GLUT4 jest jedną z przyczyn insulinooporności w cukrzycy typu 2^2,3.

Translokację GLUT4 z cytoplazmy do błony plazmatycznej można zwizualizować za pomocą immunocytochemii, wykorzystując przeciwciała specyficzne dla GLUT4 sprzężone z fluoroforem.

W niniejszej pracy opisujemy technikę ilościowego oznaczania całkowitej translokacji GLUT4 do błony komórkowej w określonym czasie, z wykorzystaniem cytometrii przepływowej. Protokół ten jest szybki (trwa mniej niż 4 godziny, wliczając inkubację z insuliną) i pozwala na analizę od zaledwie 3 000 do nawet 1 miliona komórek na warunek w ramach jednego eksperymentu. Metoda opiera się na zastosowaniu przeciwciał anty-GLUT4 skierowanych przeciwko epitopowi zewnętrznemu transportera, które wiążą się z nim natychmiast po jego wystawieniu na środowisko pozakomórkowe w wyniku translokacji do błony komórkowej.

Protokół

1. Barwienie komórek

1. Przygotować komórki. Należy użyć komórek znajdujących się w fazie aktywnego wzrostu (60-80% konfluencji). Komórki poddać głodzeniu surowiczemu przez noc, wysiać w gęstości 0,1 miliona komórek na dołek w 0,5 mL pożywki bezsurowiczej w płytce 24-dołkowej i inkubować w inkubatorze (37°C, 5% CO₂) od 30 min do 2 h w celu regeneracji po trypsynizacji.
2. Przygotować mieszaninę przeciwciał pierwszorzędowych i drugorzędowych. Wymieszać (5 μL pierwszorzędnego przeciwciała anty-GLUT4 z 1 μL drugorzędnego przeciwciała kurczego anty-kozie IgG sprzężonego z AlexaFluor 488) pomnożone przez liczbę dołków. Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej, w ciemności.
3. Przygotować 2-krotny roztwór roboczy insuliny poprzez jej rozcieńczenie w pożywce.
4. Sprawdzić, czy komórki przywarły do podłoża.
5. Ostrożnie dodać 6 μL mieszaniny przeciwciał oraz 0,5 mL 2-krotnego roztworu roboczego insuliny do dołków zawierających komórki. Unikać turbulencji pożywki. Inkubować (37°C, 5% CO₂) przez 30 minut, w ciemności.
6. Utrwalić komórki, dodając do każdego dołka 0,5 mL PBS + 1% PFA, unikając wstrząsania komórek. Inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej, w ciemności.
7. Jeśli komórki przywarły do dołków, ostrożnie zebrać je za pomocą scrapera do komórek (cell lifter). Przenieść komórki (łącznie 1 mL) do probówek kompatybilnych z cytometrem przepływowym i odwirować w celu osadzenia komórek.
8. Przemyć osad dwukrotnie 1 mL PBS i resuspendować w 0,4 mL PBS + 1% PFA. Na tym etapie probówki z komórkami można owinąć folią i przechowywać w lodówce (4-8°C) lub przenieść do cytometru przepływowego w celu natychmiastowego pozyskania danych.

2. Pozyskiwanie danych

1. Wyznacz szeroki bramkę wokół żywych komórek na panelu rozpraszania bocznego (SSC) w funkcji rozpraszania przedniego (FCS). Użyj próbki negatywnej (komórki niepoddane działaniu insuliny lub komórki „barwione” kontrolą izotypową), aby ustawić parametr FL1. Upewnij się, że cały pik znajduje się w obrębie panelu i nie jest ucięty z dolnej strony.
2. Zdobądź dane z co najmniej 10 000 komórek na próbkę.

3. Analiza danych

1. Wyznacz bramkę wokół żywych komórek w panelu SSC vs FSC (Rycina 1A). Przedstaw histogramy intensywności fluorescencji AlexaFluor 488 w funkcji liczby komórek w obrębie bramki żywych komórek (Rycina 1B). Można nałożyć na siebie różne histogramy w celu wizualizacji różnic, jednak do celów ilościowych należy wyznaczyć średnią oraz medianę intensywności fluorescencji dla każdej populacji komórek i wykorzystać te wartości do porównań (Rycina 1C).
2. Znormalizuj dane do wartości uzyskanej w przypadku braku insuliny, zgodnie z przedstawionymi na Ryciniach 1C i 1D.

4. Reprezentatywne wyniki

W mioblastach wyizolowanych od zdrowej osoby (bez insulinooporności), insulina indukuje zależną od dawki translokację GLUT4 z cytoplazmy do błony komórkowej (Rysunek 1, lewo). W przeciwieństwie do tego, insulina nie indukuje translokacji GLUT4 do błony komórkowej mioblastów wyizolowanych od pacjenta z insulinoopornością (Rysunek 1, prawo).

Rysunek 1. Przykład eksperymentu z barwieniem. Mioblasty wyizolowano od dawcy bez insulinooporności (lewo) oraz od pacjenta z insulinoopornością (prawo). A, Wykres SSC (rozproszenie boczne) względem FCS (rozproszenie przednie) z bramką wyznaczającą żywe komórki. B, Komórki wyselekcjonowane bramką w punkcie A, zabarwione przeciwciałem przeciwko zewnętrznemu epitopowi GLUT4 i pozostawione bez stymulacji (czerwony) lub stymulowane insuliną 1 nM (niebieski), 10 nM (pomarańczowy) lub 100 nM (zielony). Dla przejrzystości rysunku, w przypadku komórek z insulinoopornością przedstawiono jedynie dane bez insuliny oraz z insuliną 100 nM. C, Średnie intensywności fluorescencji (MFI) z histogramów pokazanych w punkcie B zostały znormalizowane do MFI komórek pozostawionych bez stymulacji (brak insuliny). D, Wykresy znormalizowanych danych MFI z histogramów pokazanych w punkcie B.

Dyskusja

Zaprezentowaliśmy szybką technikę ilościowego oznaczania translokacji GLUT4 z cytoplazmy do błony komórkowej za pomocą cytometrii przepływowej.

GLUT4 jest wyrażany w błonie komórkowej komórek jedynie przejściowo i ulega endocytozie. Ponieważ związane przeciwciała pozostają przytwierdzone do GLUT4, nawet podczas endocytozy, sygnał fluorescencyjny wskazuje całkowitą ilość GLUT4, która była wyeksponowana w błonie komórkowej w wybranym czasie inkubacji w obecności insuliny.

Tę technikę można również zastosować do badania translokacji innych białek z przedziału wewnątrzkomórkowego do błony komórkowej, pod warunkiem dostępności odpowiedniego przeciwciała skierowanego przeciwko zewnętrznemu epitopowi badanego białka. Na przykład podobny test jest obecnie powszechnie stosowany do oceny szybkości degranulacji cytotoksycznych limfocytów T oraz limfocytów natural killer poprzez pomiar translokacji CD107a do ich błony komórkowej^4,5. Translokacja fosfatydyloseryny z wewnętrznej strony błony komórkowej na stronę zewnętrzną podczas apoptozy lub nekrozy komórek może być również wykrywana za pomocą cytometrii przepływowej z użyciem znakowanej fluorochromem Annexin V⁶.

Poza szybkością analizy, cytometria przepływowa oferuje zaletę umożliwienia badania translokacji białek do błony komórkowej w mieszanych populacjach komórek. W rzeczywistości można połączyć barwienie markerów podgrup komórkowych z barwieniem badanego białka, a następnie przeprowadzić akwizycję danych na wielolaserowym cytometrze przepływowym⁷.

Ilości przeciwciał podane w akapicie 1.2 protokołu stanowią punkt wyjścia; zalecamy miareczkowanie przeciwciał z wykorzystaniem badanych komórek w celu ustalenia minimalnego stężenia przeciwciał dającego maksymalny sygnał. Dobrym zakresem początkowym dla zastosowanego tutaj pierwszorzędowego przeciwciała anty-ludzkiego GLUT4 byłoby 1-10 μL na probówkę (tj. 0,2-2 μg przeciwciał na probówkę), przy założeniu, że każda probówka zawiera nie więcej niż 1 milion komórek. W przypadku innych przeciwciał pierwszorzędowych należy stosować się do instrukcji dostawcy.

Normalizacja danych jest niezbędna, ponieważ autofluorescencja komórek różni się w zależności od dawcy oraz od konkretnego eksperymentu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Przeciwciała anty-ludzkie GLUT4	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	sc-1606	Przeciwko zewnętrznemu epitopowi GLUT4
Kurze przeciwciała anty-kozie IgG sprzężone z AlexaFluor 488	Invitrogen	A-21467
Rekombinacyjna ludzka insulina	Sigma-Aldrich	I2643
Podkładki do przenoszenia komórek	VWR international	29942-118	Docięte do rozmiaru dołków
Probówki 5 ml do FACS	VWR international	60819-138	Kompatybilne ze wszystkimi urządzeniami BD