Niniejszy protokół opisuje szybką technikę ilościowego oznaczania translokacji GLUT4 z cytoplazmy do błony plazmatycznej komórek za pomocą cytometrii przepływowej.
Artykuł metodologiczny
Ilościowy pomiar translokacji GLUT4 do błony komórkowej przy użyciu cytometrii przepływowej
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Glukoza jest głównym źródłem energii dla organizmu, co wymaga stałej regulacji jej stężenia we krwi. Wydzielanie insuliny przez trzustkę indukuje pobór glukozy przez tkanki wrażliwe na insulinę, przede wszystkim przez mózg, mięśnie szkieletowe i adipocyty. Pacjenci cierpiący na cukrzycę typu 2 i/lub otyzację często rozwijają insulinooporność i nie są w stanie kontrolować homeostazy glukozy. Nowe spostrzeżenia dotyczące mechanizmów insulinooporności mogą dostarczyć nowych strategii leczenia cukrzycy typu 2.
Rodzina transporterów glukozy GLUT składa się z trzynastu członków rozmieszczonych w różnych tkankach w całym organizmie1. Transporter glukozy typu 4 (GLUT4) jest głównym transporterem pośredniczącym w pobieraniu glukozy przez tkanki wrażliwe na insulinę, takie jak mięśnie szkieletowe. Po związaniu insuliny z jej receptorem pęcherzyki zawierające GLUT4 przemieszczają się z cytoplazmy do błony komórkowej, indukując pobieranie glukozy. Zmniejszona translokacja GLUT4 jest jedną z przyczyn insulinooporności w cukrzycy typu 22,3.
Translokację GLUT4 z cytoplazmy do błony plazmatycznej można zwizualizować za pomocą immunocytochemii, wykorzystując przeciwciała specyficzne dla GLUT4 sprzężone z fluoroforem.
W niniejszej pracy opisujemy technikę ilościowego oznaczania całkowitej translokacji GLUT4 do błony komórkowej w określonym czasie, z wykorzystaniem cytometrii przepływowej. Protokół ten jest szybki (trwa mniej niż 4 godziny, wliczając inkubację z insuliną) i pozwala na analizę od zaledwie 3 000 do nawet 1 miliona komórek na warunek w ramach jednego eksperymentu. Metoda opiera się na zastosowaniu przeciwciał anty-GLUT4 skierowanych przeciwko epitopowi zewnętrznemu transportera, które wiążą się z nim natychmiast po jego wystawieniu na środowisko pozakomórkowe w wyniku translokacji do błony komórkowej.
Protokół
1. Barwienie komórek
- Przygotuj komórki. Należy użyć komórek w fazie aktywnego wzrostu (60-80% konfluencji). Poddaj komórki głodzeniu surowiczemu przez noc, wysiej je w gęstości 0,1 miliona komórek na dołek w 0,5 mL medium bezsurowiczego na płytce 24-dołkowej i inkubuj w inkubatorze (37°C, 5% CO2) od 30 min do 2 h, aby odzyskały sprawność po trypsynizacji.
- Przygotuj mieszaninę przeciwciał pierwszorzędowych i drugorzędowych. Wymieszaj (5 μL pierwszorzędowego przeciwciała anty-GLUT4 z 1 μL drugorzędowego przeciwciała przeciwko IgG koziego pochodzenia z kurczaka sprzężonego z AlexaFluor 488) pomnożone przez liczbę dołków. Inkubuj przez 10 minut w temperaturze pokojowej, w ciemności.
- Przygotuj 2X roztwór roboczy insuliny poprzez jej rozcieńczenie w medium.
- Sprawdź, czy komórki przywarły do podłoża.
- Ostrożnie dodaj 6 μL mieszaniny przeciwciał oraz 0,5 mL 2X roztworu roboczego insuliny do dołków zawierających komórki. Unikaj turbulentnego mieszania medium. Inkubuj (37°C, 5% CO2) przez 30 minut w ciemności.
- Utrwal komórki, dodając do każdego dołka 0,5 mL PBS + 1% PFA, unikając wstrząsania komórkami. Inkubuj przez 20 minut w temperaturze pokojowej, w ciemności.
- Jeśli komórki przywarły do dołków, delikatnie oderwij je za pomocą scrapera do komórek. Przenieś komórki (łącznie 1 mL) do probówek kompatybilnych z cytometrem przepływowym i odwiruj, aby uzyskać osad komórkowy.
- Przemyj osad dwukrotnie 1 mL PBS i resuspenduj w 0,4 mL PBS + 1% PFA. Na tym etapie probówki z komórkami można owinąć folią i przechowywać w lodówce (4-8°C) lub przenieść do cytometru przepływowego w celu natychmiastowej akwizycji danych.
2. Pozyskiwanie danych
- Ustaw szerokie bramkowanie wokół żywych komórek na panelu rozproszenia bocznego (SSC) względem rozproszenia przedniego (FCS). Użyj próbki negatywnej (komórek niepoddanych działaniu insuliny lub komórek „obarwionych” kontrolą izotypową), aby ustawić parametr FL1. Upewnij się, że cały pik znajduje się w obrębie panelu i nie jest ucięty od dołu.
- Zebierz dane z co najmniej 10 000 komórek z każdej próbki.
3. Analiza danych
- Wyznacz bramkę wokół żywych komórek na panelu SSC vs FSC (Rycina 1A). Przedstaw histogramy intensywności fluorescencji AlexaFluor 488 w funkcji liczby komórek wewnątrz bramki żywych komórek (Rycina 1B). Można nałożyć na siebie różne histogramy, aby zwizualizować różnice, jednak w celu ilościowego oznaczenia należy wyznaczyć średnią oraz medianę intensywności fluorescencji dla każdej populacji komórek i wykorzystać te wartości do porównań (Rycina 1C).
- Znormalizuj dane do wartości uzyskanej w warunkach braku insuliny, zgodnie z Rycinami 1C i 1D.
4. Reprezentatywne wyniki
W mioblastach wyizolowanych od zdrowego osobnika (bez insulinooporności), insulina indukuje zależną od dawki translokację GLUT4 z cytoplazmy do błony komórkowej (Rycina 1, lewa). W przeciwieństwie do tego, insulina nie indukuje translokacji GLUT4 do błony komórkowej mioblastów wyizolowanych od pacjenta z insulinoopornością (Rycina 1, prawa).
Rycina 1. Przykład eksperymentu z barwieniem. Mioblasty wyizolowano od dawcy bez insulinooporności (lewo) oraz od pacjenta z insulinoopornością (prawo). A, Wykres SSC (rozproszenie boczne) względem FCS (rozproszenie przednie) z bramką wokół żywych komórek. B, Komórki wybrane bramką w A, zabarwione przeciwciałem przeciwko zewnętrznemu epitopowi GLUT4 i pozostawione bez stymulacji (czerwony) lub stymulowane insuliną w stężeniu 1 nM (niebieski), 10 nM (pomarańczowy) lub 100 nM (zielony). Dla przejrzystości rysunku, w przypadku komórek z insulinoopornością przedstawiono jedynie dane bez insuliny oraz z insuliną 100 nM. C, Średnie intensywności fluorescencji (MFI) z histogramów pokazanych w B zostały znormalizowane do MFI komórek pozostawionych bez stymulacji (brak insuliny). D, Wykresy znormalizowanych danych MFI z histogramów pokazanych w B.
Dyskusja
Zaprezentowaliśmy szybką technikę ilościowego oznaczania translokacji GLUT4 z cytoplazmy do błony komórkowej za pomocą cytometrii przepływowej.
GLUT4 jest wyrażany w błonie komórkowej komórek jedynie przejściowo i ulega endocytozie. Ponieważ związane przeciwciała pozostają przytwierdzone do GLUT4, nawet podczas endocytozy, sygnał fluorescencyjny wskazuje całkowitą ilość GLUT4, która była wyeksponowana w błonie komórkowej w wybranym czasie inkubacji w obecności insuliny.
Tę technikę można również zastosować do badania translokacji innych białek z przedziału wewnątrzkomórkowego do błony komórkowej, pod warunkiem dostępności odpowiedniego przeciwciała skierowanego przeciwko zewnętrznemu epitopowi badanego białka. Na przykład podobny test jest obecnie powszechnie stosowany do oceny szybkości degranulacji cytotoksycznych limfocytów T oraz limfocytów natural killer poprzez pomiar translokacji CD107a do ich błony komórkowej4,5. Translokacja fosfatydyloseryny z wewnętrznej strony błony komórkowej na stronę zewnętrzną podczas apoptozy lub nekrozy komórek może być również wykrywana za pomocą cytometrii przepływowej z użyciem znakowanej fluorochromem Annexin V6.
Poza szybkością analizy, cytometria przepływowa oferuje zaletę umożliwienia badania translokacji białek do błony komórkowej w mieszanych populacjach komórek. W rzeczywistości można połączyć barwienie markerów podgrup komórkowych z barwieniem badanego białka, a następnie przeprowadzić akwizycję danych na wielolaserowym cytometrze przepływowym7.
Ilości przeciwciał podane w akapicie 1.2 protokołu stanowią punkt wyjścia; zalecamy miareczkowanie przeciwciał z wykorzystaniem badanych komórek w celu ustalenia minimalnego stężenia przeciwciał dającego maksymalny sygnał. Dobrym zakresem początkowym dla zastosowanego tutaj pierwszorzędowego przeciwciała anty-ludzkiego GLUT4 byłoby 1-10 μL na probówkę (tj. 0,2-2 μg przeciwciał na probówkę), przy założeniu, że każda probówka zawiera nie więcej niż 1 milion komórek. W przypadku innych przeciwciał pierwszorzędowych należy stosować się do instrukcji dostawcy.
Normalizacja danych jest niezbędna, ponieważ autofluorescencja komórek różni się w zależności od dawcy oraz od konkretnego eksperymentu.
Oświadczenia
Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Praca ta była wspierana grantami z funduszu Mrs. Clifford Elder White Graham Endowed Research Fund oraz NIH (AR059838) dla CB, z NIH (AR052791, AR044387-ARRA oraz NS063298) dla LTT, a także przez Baylor College of Medicine Cytometry and Cell Sorting Core dzięki finansowaniu z NIH (NCRR S10RR024574, NIAID AI036211 oraz NCI P30CA125123). Treść opracowania jest wyłączną odpowiedzialnością autorów i nie musi odzwierciedlać oficjalnych stanowisk NIH.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Przeciwciała anty-ludzkie GLUT4 | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-1606 | Przeciwko zewnętrznemu epitopowi GLUT4 |
| Kurze przeciwciała anty-kozie IgG sprzężone z AlexaFluor 488 | Invitrogen | A-21467 | |
| Rekombinacyjna ludzka insulina | Sigma-Aldrich | I2643 | |
| Podkładki do przenoszenia komórek | VWR international | 29942-118 | Docięte do rozmiaru dołków |
| Probówki 5 ml do FACS | VWR international | 60819-138 | Kompatybilne ze wszystkimi urządzeniami BD |
Bibliografia
- Zhao, F. Q., Keating, A. F. Functional properties and genomics of glucose transporters. Curr. Genomics. 8, 113-128 (2007).
- Karnieli, E., Armoni, M. Transcriptional regulation of the insulin-responsive glucose transporter GLUT4 gene: from physiology to pathology. Am. J. Endocrinol. Metab. 295, 38-45 (2008).
- Graham, T. E., Kahn, B. B. Tissue-specific alterations of glucose transport and molecular mechanisms of intertissue communication in obesity and type 2 diabetes. Horm. Metab. Res. 39, 717-721 (2007).
- Alter, G., Malenfant, J. M., Altfeld, M. CD107a as a functional marker for the identification of natural killer cell activity. J. Immunol. Methods. 294, 15-22 (2004).
- Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H., Reutellingsperger, C. A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labeled Annexin V. J. Immunol. Methods. 184, 39-51 (1995).
- Lugli, E., Roederer, M., Cossarizza, A. Data analysis in flow cytometry: the future just started. Cytometry A. 77, 705-713 (2010).
Przedruki i uprawnienia
