Transfekcja indukowalnego systemu ekspresji genów do komórek ekspresujących bakteryjne białko efektorowe

Streszczenie

Źródło: Berens, C. i in. Zastosowanie systemu indukowalnej ekspresji do badania interferencji czynników zjadliwości bakteryjnej z sygnalizacją wewnątrzkomórkową. J. Vis. Exp. (2015)

Ten film pokazuje zastosowanie indukowalnego systemu ekspresji do identyfikacji, gdzie bakteryjne białko efektorowe CaeB zakłóca apoptotyczną kaskadę gospodarza. Opisuje ona kroki transfekujące komórki ekspresujące CaeB za pomocą systemu reagującego na tetracyklinę, aby indukować ekspresję genów pro-apoptotycznej w celu zidentyfikowania punktu zakłócenia w kaskadzie.

Protokół

1. Transfekcja stabilnej linii komórkowej za pomocą systemu wektorów ekspresji indukowalnej

1. Nasiać ludzkie embrionalne komórki nerkowe (HEK)293 stabilnie wyrażające zielone białko fluorescencyjne (GFP) (GFP-CaeB) w płytkach z 12 dołkami o gęstości 1 x 10^{5 komórek} /dołek.
2. 19 godzin po zasiewaniu współtransfekcuj komórki plazmidem regulatorowym i plazmidem odpowiedzi, kodującym Bax lub aktywowaną kaspazą 3.
   1. Współtransfekcować stabilne komórki HEK293 za pomocą 100 ng plazmidu regulatora pWHE125-P (Rysunek 1) oraz 100 ng plazmidów odpowiedzi pWHE655-hBax lub pWHE655-revCasp3 (Rysunek 2) oraz 0,4 μl polietyliminy.
   2. Przygotuj odczynnik transfekcyjny kwasu deoksyrybonukleinowego (DNA) i polietyliminy każdy w 75 μl medium Opti-MEM i inkubuj dokładnie przez 5 minut w temperaturze pokojowej (RT). Do powstawania złożonego należy inkubować obie mieszaniny razem przez 15 minut w stanie RT.
3. Roztwór polietyliminy/DNA należy kroplami do komórek i inkubuj w temperaturze 37 °C w 5%_CO2.

2. Indukcja apoptozy

1. 5 godzin po transfekcji indukować ekspresję białek pro-apoptoty poprzez dodanie 1 μg/ml doksycykliny do pożywki hodowlanej. Inkubuj komórki przez 18 godzin w temperaturze 37 °C w 5%_CO2.

Wyniki

Rysunek 1. Schematyczny przegląd plazmidu regulacyjnego pWHE125. Elementy niezbędne do propagacji u bakterii, w tym źródło replikacji (ori pBR) oraz kaseta oporna na antybiotyki przeciwko ampicylinie (Amp^R), a także do ekspr...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
DMEM	Technologie życia	31966-021
FCS	Biochrom	S0115
Pen/Streptokok	Technologie życia	15140-122
OptiMEM	Technologie życia	51985
X-tremeGENE 9	Roche	6365752001
Polietyimina	Polyscienes	23966
Doksycyklina	Sigma Aldrich	D9891