Obrazowanie lokalizacji bakteryjnej i interakcji gospodarza w ludzkiej tkance płucnej

Streszczenie

Źródło: Mills, B. i in., Optyczne przesiewowe badania sond specyficznych dla nowych bakterii na tkance płuc człowieka ex vivo za pomocą konfokalnej endoskopii laserowej. J. Vis. Exp. (2017)

Ten film pokazuje obrazowanie w czasie rzeczywistym fluorescencyjnie oznakowanego Staphylococcus aureus w zawiesinie i tkance płucnej za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej konfokalnej z włóknistą mikroskopią.

Protokół

1. Zbieranie danych za pomocą konfokalnej endoskopii laserowej (CLE)
   1. Po ustawieniu otworzy się okno do wyboru miejsca przechowywania i prefiksu pliku. Wybierz pożądany folder do przechowywania danych i odpowiednio nadaj prefiks.
   2. Ustaw pedały tak, aby były łatwo dostępne dla operatora. Lewy pedał: włącz/wyłącz laser; środkowy pedał: pauza; Prawy pedał: nagrywaj/stop.
      UWAGA: Sterowanie laserowe można również obsługiwać za pomocą przycisków na ekranie.
   3. Kliknij 'start' na ekranie lub naciśnij lewy pedał nożny, aby włączyć laser. To rozpocznie akwizję i uzyska obrazy przy użyciu 100% mocy lasera i liczby klatek na sekundę 12 klatek na sekundę (ustawienia domyślne).
      UWAGA: W innych zastosowaniach te ustawienia można zmieniać na ekranie, jeśli zajdzie taka potrzeba, w zależności od typu próbki.
   4. Zrób zdjęcia każdej z próbek zawiesiny bakteryjnej.
      1. Włóż dalszy koniec światła obrazującego FCFM (fibrowana konfokalna mikroskopia fluorescencyjna) i powoli przesuwaj włókno przez zawiesinę, aby zbadać próbkę.
      2. Nagrywaj filmy dowolnej długości (do 10 minut), naciskając prawy pedał nożny lub wybierając na ekranie przyciski nagrywania, gdy światłowód porusza się powoli wokół próbki.
      3. Oczyść dalszy koniec światłowodu obrazującego FCFM 8%_H2O2i oczyścić tkanki soczewek między próbkami. ​
         UWAGA: Typowe długości wideo 10-30 sekund wystarczają do obrazowania in vitro .
   5. Zrób zdjęcia każdej z próbek tkanki płuc.
      1. Włóż dalszy koniec światła obrazującego FCFM do próbki, zapewniając bezpośredni kontakt między końcem włókna a tkanką. Delikatnie przesuwaj koniec włókna obrazującego, aby zbadać próbkę.
         UWAGA: Podniesienie końca włókna od tkanki usuwa tkankę z płaszczyzny ogniskowej; jednak może to być używane do obrazowania oznakowanych bakterii, które nie są przyczepione do tkanki.
      2. Nagrywaj filmy dowolnej długości (do 10 minut), naciskając prawy pedał nożny lub wybierając na ekranie przyciski nagrywania, gdy światłowód porusza się powoli wokół próbki.
         UWAGA: Zazwyczaj do obrazowania ex vivo tkanek wystarczą długości wideo sięgające 30 sekund.
      3. Oczyść dalszy koniec światła obrazującego FCFM chusteczkami czyszczącymi soczewki i 8% _H2O2pomiędzy próbkami.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
1-14 Microfuge	SciQuip	90616	Mała mikrowirówka stołowa
Płyta z 96 dołami	Corning	3370	Płytka do testowania
Calcein AM	Sigma Aldrich	17783	Komercyjny barwnik fluorescencyjny
Cellvizio 488 nm Research CLE	Mauna Kea Technologies	LC-0001-488	Konfokalne urządzenie do endoskopii laserowej
Cletop-S	Cletop	14110601	Oczyszczacz włókna
Eppendorf (1,5 mL)	Eppendorf	30120086	1,5 mL mikrofugeurki
Buforowana sól fizjologiczna Gibco Phosphate	Thermo Fisher Scientific	10010023	PBS – medium płukania
IC-Viewer	Mauna Kea Technologies	LW-0001	Oprogramowanie do zbierania i przetwarzania danych dla systemu badawczego CellVizio 488 nm
Badania niestandardowe AlveoFlex 488 nm	Mauna Kea Technologies	MP-0002-AF3	Włókno do mikroskopii fluorescencyjnej włóknistej w konfokalnej mikroskopii
Quanti Kit 488 nm	Mauna Kea Technologies	LQ-0005	Zestaw kalibracyjny dla systemu CellVizio 488
S. aureus ATCC 25923	ATCC	25923	Szczep bakteryjny stosowany w tym badaniu
Kuweta do półmikrospektrofotometrii	Sigma Aldrich	C5416-100EA	Do spektrofotometrii
Komfort termomiksera	Eppendorf	41102422	Ogrzewanie stołowe z wstrząsaniem