Bioluminescencja zakażeń bakteryjnych u myszy

Streszczenie

Źródło: de Vries, C. R. i in., A Delayed Inoculation Model of Chronic Pseudomonas aeruginosa Wound Infection. J. Vis. Exp. (2020).

Ten film demonstruje bioluminescencyjną technikę obrazowania monitorującego postęp infekcji bakteryjnej na żywym modelu myszy. Bakterie patogenne opracowane z systemem raportu luxABCDE emitują światło w miejscu zakażenia, umożliwiając wizualizację bakterii aktywnych przemianownie. Obrazując mysz w czasie, naukowcy mogą nieinwazyjnie śledzić dynamikę infekcji i ilościowo określać intensywność sygnału bioluminescencyjnego.

Protokół

1. Przygotowanie i wzrost bakterii

1. Przeprowadz całą pracę z P. aeruginosa i zwierzętami z zachowaniem środków ostrożności BSL-2 zgodnie z wytycznymi instytucjonalnego komitetu ds. biobezpieczeństwa oraz komisji ds. wykorzystania zwierząt badacz. Wszystkie opisane tutaj kroki dotyczące P. aeruginosa, w tym szczepienie myszy, wykonuj w szafce z zabezpieczeniem biologicznym.
2. Luminescencyjny szczep PAO1:lux P. aeruginosa jest dostępny w naszym laboratorium na życzenie. Streak PAO1, przechowywany jako mrożony bulion glicerolowy, na agarze Lysogeny Bulion (LB). Dla luminescencyjnego szczepu PAO1:lux agar LB powinien zawierać selektywne antybiotyki (100 μg/mL karbenicyliny i 12,5 μg/mL kanamycyny). Uprawiaj w temperaturze 37 °C przez noc w inkubatorze bakteryjnym.
3. Zbierz poizolowaną kolonię i uprawiaj przez noc w 37 °C w podłożu 3 ml LB, pH 7,4. W przypadku luminescencyjnych szczepów bulion powinien zawierać 100 μg/mL karbanenicyliny. Uprawiaj w drżących, tlenowych warunkach.

2. Przygotowanie procedury

1. Niech wszyscy pracownicy wykonujący operację noszą czystą fartuch/fartuch laboratoryjny, maseczkę na twarz, siatkę na włosy i rękawiczki.
2. Autoklaw wszystkie narzędzia chirurgiczne, w tym nożyczki i kleszcze. Stosuj technikę aseptyczną do sterylizacji narzędzi między zwierzętami.
3. Oczyść stół operacyjny etanolem i przygotować czyste pole operacyjne.

3. Usuwanie owłosienia

1. Znieczulać myszy C57BL/6J w wieku 8–12 tygodni przy użyciu izofluranu w 1%–3%. Badacze powinni stosować się do wytycznych personelu weterynaryjnego swojej placówki dotyczącego znieczulenia podczas stosowania izofluranu.
   1. Rozpocznij znieczulenie od podania 1%–3% izofluranu i dostosuj przepływ tlenu do 1,5 L/min. Włóż mysz do komory indukcyjnej.
   2. Uszczypnij mysz w palec u nogi, by ocenić głębokość znieczulenia. Gdy mysz przestaje reagować na stymulację, wyjmij ją z komory indukcyjnej i umieść na stole chirurgicznym z nosem w stożku izofluranowym.
   3. Nałóż lubrykant oczny na oba oczy.
2. Zważ mysz, aby uzyskać bazową wagę przed zabiegiem.
3. Ustaw mysz w pozycji leżącej. Podskórnie wstrzyknąć myszy podskórnie podgrzaną, sterylną zawartość 0,9% chlorku sodu, 250 μL na każdym boku, co daje łącznie 500 μL.
4. Ogol grzbietową część myszy za pomocą golarki elektrycznej. Golenie powinno odbywać się w innym miejscu niż stanowisko chirurgiczne, aby zapobiec zanieczyszczeniu rany przez owłosienie.
5. Nałóż cienką warstwę balsamu do depilacji. Pozwól balsamowi odczekać 20–60 sekund. Usuń włosy i nadmiar balsamu gazą zwilżoną w ciepłej wodzie. Po usunięciu włosów przejdź do zabiegu wycięcia.

4. Operacja wycięcia rany o pełnej grubości

1. Wstrzyknij buprenorfinę o przedłużonym uwalnianiu 0,6–1 mg/kg podskórnie, używając igły 25 g w środkowej części grzbietowej myszy. Buprenorfina o powolnym uwalnianiu łagodzi ból w ciągu 48–72 godzin.
2. Dezynfekuj miejsce operacji. Przetrzyj powierzchnię grzbietową sterylnym wymazem betadyny. Przetrzyj nadmiar Betadine sterylnym wymazem alkoholowym. Należy to wykonać 3 razy (na przemian betadyna i alkohol), wymazując się od środka okrężnie do krawędzi. Pozwól temu miejscu wyschnąć na powietrzu.
3. Stwórz zasłonę wokół miejsca operacji, używając sterylnej gazy lub folii spożywczej.
4. Rozciągnij skórę napiętą na kaudzie. Użyj sterylnego ciosu do biopsji skóry o średnicy 6 mm, aby wykonać początkowe nacięcie przez lewą grzbietową skórę. Powtórz na prawym grzbietowym naskórku.
5. Użyj kleszczy, aby otworzyć skórę od środka lewego obrysu rany. Wyciąć warstwy naskórka i skóry nożyczkami. Powtórz to na prawym obrysie rany, aby uzyskać symetryczne rany wycinające.
6. Płucz rany 50 μL bezpłodnej soli fizjologicznej. Pozwól miejscu operacji i otaczającej skórze wyschnąć na powietrzu. Następnie przykryj rany i grzbiet przezroczystym opatrunkiem foliowym.
7. Umieść mysz z powrotem w czystej klatce. Dom 1 zwierzę na klatkę.
8. Umieść klatkę na poduszce grzewczej i obserwuj, aż mysz się obudzi.
9. Podczas wykonywania powyższego zabiegu na wielu zwierzętach używaj sterylizatora gorących kulek do czyszczenia wszystkich narzędzi chirurgicznych między zwierzętami.
10. Należy odczekać 24 godziny na powrót myszy do siebie po zabiegu chirurgicznym oraz na utworzenie tymczasowej matrycy rany na ranach przed przystąpieniem do szczepienia bakteriami.

5. Szczepienie P. aeruginosa

1. Rozcieńcz nocną hodowlę PAO1:lux do OD600 = 0,05 w 75 mL podłoża LB zawierającego 100 μg/mL karbenicyliny i hoduj bakterie aż do wczesnej fazy wykładniczej (OD₆₀₀ ≈ 0,3). Powinno to zająć około 2–3 godziny.
2. Rozcieńczony PAO1: luks w PBS do stężenia (7,5 ± 2,5) x 10² CFU/mL. Upewnij się, że przygotujesz nadmiar inokulum, aby zapewnić odpowiednią objętość i umożliwić nakładanie po eksperymencie. Jeśli transportujesz między placówkami (np. z laboratorium do wiwarium), użyj podwójnego zabezpieczenia w szczelnie szczelnym pudełku oznaczonym jako Biohazard.
3. Wszystkie prace z P. aeruginosa i myszami wykonuj z użyciem zatwierdzonego sprzętu ochrony osobistej w szafce bezpieczeństwa biologicznego Animal Biosafety Level 2 (ABSL-2) zatwierdzonej (BSC). Urządzenia wielokrotnego użytku, takie jak waga, powinny być przykryte folią spożywczą, aby zapobiec zanieczyszczeniu.
4. Znieczulanie za pomocą izofluranu 3%, jak opisano powyżej. Zważ mysz i zapisz wagę. Podskórnie wstrzyknąć myszy podskórnie podgrzaną, sterylną zawartość 0,9% chlorku sodu, 250 μL na każdym boku, co daje łącznie 500 μL.
5. Jeśli przezroczysty opatrunk folii myszy zszedł z dnia na dzień, ostrożnie usuń powstałe strupy i nałóż nowy opatrunk.
6. Użyj strzykawki z kapturą gruźlicyny 27 G, aby wstrzyknąć 40 μL zawiesiny PAO1:lux przez przezroczystą folię do każdej rany. Do kontroli ran niezaszczepionych/PBS należy stosować różne myszy, aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu po stronie przeciwległej.
7. Umieść mysz z powrotem w klatce na termoforze i monitoruj, aż się obudzi. Wszystkie myszy powinny być trzymane osobno w osobnych klatkach, aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu.
8. Umieść wysokokaloryczną pastę z suplementami diety umieszczoną między granulkami jedzenia na dnie klatki.
9. Użyj pozostałego inokulum do naniesienia na płytkę agaru LB. Policz kolonie, aby potwierdzić liczbę podanych bakterii.

6. Obrazowanie in vivo zakażonych ran

1. Należy stosować protokoły zabezpieczające BSL-2 do transportu myszy do i z instrumentu obrazowania, w tym użycie dodatkowego pojemnika. Uważaj, aby nie przenosić ani nie upuścić żadnej ściółki zwierzęcej podczas przenoszenia myszy do komory indukcyjnej lub instrumentu obrazującego.
2. Indukować znieczulenie myszy poprzez wdychanie 1% – 3% izofluranu w komorze indukcyjnej.
3. Po znieczuleniu mysz należy ją ułożyć w pozycji leżącej w komorze obrazującej systemu optycznego z nosem w stożku izofluranowym.
4. Otwórz program.
5. Parametry akwizycji będą się różnić w zależności od liczby zwierząt obrazowanych jednocześnie oraz intensywności bioluminescencji. Podstawowe parametry do ustawienia to czas naświetlania, binning, f/stop oraz pole widzenia (FOV). Domyślne ustawienia początkowe to czas ekspozycji 30 sekund, binowanie niskiego (2), f/stop 1,2 i FOV 25. Dostosowuj te ustawienia w zależności od potrzeb badacza.
6. Analizuj dane luminescencji za pomocą programu obrazowania. Luminescencja będzie przedstawiona jako pseudokolorowy obraz nałożony na kolorowe zdjęcie myszy.
   1. Stwórz obszar zainteresowania (ROI) w miejscu rany i zmierz średni strumień (fotony na sekundę) wykryty. Należy zauważyć, że dane mogą być również podawane jako promieniowanie (fotony/sekunda/cm²/steradian), ale dopóki odległość platformy obrazującej od kamery pozostaje stała między obrazowaniem, strumień jest wystarczający.
   2. Zmierz tło, tworząc zwrot z inwestycji w losowym obszarze platformy obrazującej. Odejmij liczbę fotonów tła na sekundę.
   3. Wyeksportuj dane do arkusza kalkulacyjnego do dalszej analizy.
7. Wykonuj obrazowanie obrazowe opisane powyżej tak często, jak codziennie, aby śledzić postęp infekcji.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Zastrzyk chlorku sodu 0,9%	Hospira	2484457
18 G x 1 sterylna igła	BD	305195
25 g x 1 1/5 sterylna igła	BD	305127
Wymaz alkoholowy	BD	326895
Oprogramowanie obrazowania Aura	Obrazowanie za pomocą instrumentów spektralnych	Nie ma
Betadyna	Purdue Frederick Company	19-065534
LABORATORIUM Buprenorfiny SR	Zoopharm	Nie ma
Męce myszy C57BL/6J	Laboratorium Jacksona	664
Jednorazowy cios do biopsji, 6 mm	Integra	33-36
Nożyczki drobne - węglik wolframu	Narzędzia Nauki Ścisłej	14568-09
Suchy sterylizator szklanych kulek	Aparat Harvarda	61-0183
Granulowany agar	BioReagenty Fishera	BP9744
Poduszka grzewcza	Milliard	804879481218
Strzykawka insulinowa z igłą 28 G	BD	329461
System obrazowania Lago X	Obrazowanie za pomocą instrumentów spektralnych	Nie ma
Bulion LB	BioReagenty Fishera	BP1426
Strzykawka Leur-Lok 1 mL	BD	309628
Mini Arco Animal Trymer	Wahl Professional	919152
Balsam do usuwania owłosienia Nair z olejkiem dla niemowląt	Church i Dwight	Nie ma	Dostępne w każdej aptece
Ośmiokątne Kleszcze	Narzędzia Nauki Ścisłej	11041-08
Szalka Petriego	Falcon	351029
Fosforanowa sól fizjologiczna (PBS) 1x	Corning	21-040-CV
Folia spożywcza do prasowania i uszczelniania	Cieszę się.	Nie ma
Strzykawka SafetyGlide Insulin z igłą 30 g	BD	305934
Strzykawka insulinowa Safetyglide, 1/2 mL, 30 G x 5/16 TW	BD	305934
Skala	Ohaus Scout Pro	SP202
Suplement suplementacji	Henry Schein Zdrowie Zwierząt	29908
Tegaderm, 6 cm x 7 cm	3M	1624W