Badanie współinfiltracyjne w celu wykrywania efektorów patogenów tłumiących wyciszanie RNA roślin

Streszczenie

Źródło: Shi, J. i inni. Przesiewowe badania i identyfikacja supresorów tłumiących RNA z wydzielanych efektorów patogenów roślinnych. J. Vis. Exp. (2020)

Ten film demonstruje test współinfiltracji w celu identyfikacji białek efektorowych patogenów, które hamują wyciszanie RNA w Nicotiana benthamiana 16c. Fluorescencjonujący raport oraz gen efektorowy kandydatów są dostarczane do liści rośliny za pomocą Agrobacterium. Zazwyczaj wyciszanie RNA degraduje transkrypcje reporterów, zmniejszając fluorescencję. Efektory tłumiące blokują tę reakcję, zachowując fluorescencję. Ten test oferuje szybką, wizualną metodę wykrywania efektorów mikrobiologicznych, które zakłócają obronę gospodarza.

Protokół

Współinfiltracja Nicotiana benthamiana liście

1. Wymieszaj równe ilości kultury Agrobacterium zawierającej 35S-GFP z kulturą Agrobacterium zawierającą 35S-wirusowy supresor, który jest mozaiką ogórka 2b (CMV2b), domniemany efektor lub pusty wektor (EV).
2. Ostrożnie i powoli infiltruj mieszane zawiesiny agrobakterii po bokach odbłokowych liści N. benthamiana 16c za pomocą bezigłowej strzykawki o pojemności 1 mL.
3. Usuń pozostałą zawiesinę bakteryjną z liści za pomocą wycieraczek do tkanek miękkich i okrąż brzegi zainfiltrowanych miejsc piórem maker.
4. Zostaw rośliny przeniknięte w komorze wzrostu w tych samych warunkach wzrostu.
   
   UWAGA: Ze względów bezpieczeństwa i zdrowia podczas infiltracji należy nosić ochronne okulary i maskę. Aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu, rękawiczki powinny być zmieniane lub sterylizowane etanolem między infiltracjami. Zazwyczaj do infiltracji potrzebne jest co najmniej 1 mL zawiesin agrobakterii na liść. Do systemowego wyciszania potrzebne będą co najmniej dwa liścia do infiltracji.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Lampa UV	Analytik Jena	UVP B-100AP	Obserwacja