Ustanowienie określonej populacji bakterii jelitowych u dorosłych komarów

Streszczenie

Źródło: Liu, X. i inni. Bakteryjny test żywienia ustnego z komarami leczonymi antybiotykami. J. Vis. Exp. (2020)

Ten film pokazuje wyczerpanie rodzimej mikrobioty jelitowej u komarów przy użyciu roztworu sacharozy zawierającej antybiotyki. Następnie następuje kontrolowana rekolonizacja z zawiesiną bakteryjną dostarczaną przez system odżywiania błonowego, aby ustanowić zdefiniowaną populację bakterii w jelicie komarów.

Protokół

1. Leczenie antybiotykami i ponowne wprowadzenie bakterii

1. Przygotuj roztwór antybiotykowy.
   1. Zważ wymaganą ilość sacharozy, penicyliny i streptomycyny, aby przygotować 10% roztwór sacharozy, w tym 20 jednostek penicyliny i 20 μg streptomycyny na mL.
2. Karm komary roztworem antybiotykowym.
   1. Znieczulaj komary w temperaturze 4 °C przez 3–5 minut. Przenieś komary do papierowego kubka. Przykryj górę gazą i otul gazę taśmą, aby zapobiec ucieczce komarów.
   2. Zanurz sterylne waciki w roztworze antybiotykowym i ostrożnie umieść je na kubku przeciwkomarowym. Przed użyciem wyciśnij waciki, aby zapobiec utonięciu komarów w ociekającej wacice.
   3. Przykryj waciki 10-centymetrową miską Petriego, aby zapobiec parowaniu wilgoci. Wymieniaj waciki dwa razy dziennie przez trzy kolejne dni.
3. Przygotowanie zawiesiny bakteryjnej
4. Zmierz roztwór bakteryjny spektrofotometrem. Dodaj 1 zawiesinę bakteryjną OD (OD₆₀₀) do probówki o pojemności 1 mL. Wiruj zawiesinę w temperaturze 5 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
5. Usuń supernatant i dodaj 1 mL sterylnego bufora 1x PBS do rurki 1,5 mL dla wydzielania zawiesien.
6. Wirówka w 5 000 x g przez 5 minut w 4 °C; Usuń supernatant.
7. Powtórz kroki 2.4.2 i 2.4.3.
8. Dodaj 200 μL jałowego buforu soli fosforanowej (PBS) do wytrącenia bakteryjnego.
9. Dodaj 600 μL roztworu sacharozy 10%, 200 μL 10 mm adenozyny 5′-trifosforanowej (ATP), która działa jako fagostymulant, oraz 200 μL zawiesiny bakteryjnej do sterylnej probówki o pojemności 1,5 mL. Mieszaj przez wirowanie.
10. Karm komara zawiesiną bakteryjną.
    1. Głodzić komary przez 24 godziny, pozwalając antybiotykom na metabolizowanie przed karmieniem bakteriami.
    2. Złóż system zasilania membraną.
    3. Uszczelnij sterylną jednostkę karmiącą parafilmem lub alternatywnie membraną kolagenową.
    4. Załóż plastikowy pierścień i przymocuj go parafilmem, aby nie pęknąć przez tarcie podczas podawania.
    5. Powoli dodawaj przygotowany roztwór bakteryjny do jednostki karmiącej.
       Uwaga: Tylko jedna studnia z jednostki doprowadzającej z dwoma dołkami może być wypełniona roztworem i pokrywa jednostkę zasilającą tylko od strony odczynnikowej.
    6. Podłącz jednostkę karmicielską do systemu karmienia podgrzanego do 37 °C, który symuluje temperaturę człowieka, aby przyciągnąć komary. Umieść urządzenie do karmienia na papierowym kubku wypełnionym komarami i karm przez 90 minut.
    7. Po karmieniu znieczulaj komary, poddając je temperaturze 4 °C przez 3–5 minut i utrzymuj je w znieczulonej misce Petriego.
    8. Wybieraj w pełni nabrzmiałe komary do dalszych badań.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Adenozynowy 5′-trifosforanowy sol solny	Sigma	A2383	Hydrat soli adenozyny 5′-trifosforanowej był używany do przygotowania standardowych roztworów adenozynotrifosforanu (ATP)
System zasilania membranowego Hemotek	Hemotek		Elementy systemu podawania, w tym regulator temperatury Hemotek, zespół obudowy podajnika, metalowy podajnik złożony.
Parafilm	Sangon Biotech	F104002	4 cale x 125 stóp
Szalka Petriego	Sangon Biotech	F611203
Penicylina G prokaina solna hydratowana	Sangon Biotech	A606248	Biały proszek. Rozpuszczalny w wodzie, rozpuszczalny w metanolu, lekko rozpuszczalny w wodzie, etanol
Siarczan streptomycyny	Sangon Biotech	A610494	Streptomycyna to antybiotyk glukozaminowy zakłócający syntezę białek prokariotycznych.
Sacharoza	Sangon Biotech	A502792	Rozpuszczalny w wodzie, etanolu i metanolu, lekko rozpuszczalny w gliceroli i pirydynie.
Bufor PBS 10X	Sangon Biotech	E607016	Ten produkt to rozwiązanie 10X. Proszę rozcieńczyć go 10 razy przed użyciem. Wartość pH wynosi 7,4.