Przygotowanie kultury Agrobacterium do dostarczania genów do komórek roślinnych

Streszczenie

Źródło: Shi, J. i in., Przesiewowe i identyfikacja supresorów wyciszających RNA z wydzielanych efektorów patogenów roślinnych. J. Vis. Exp. (2020)

Ten film pokazuje procedurę przygotowania hodowli Agrobacterium tumefaciens poprzez indukowanie ekspresji genów za pomocą acetosyringonu, a następnie usunięcie antybiotyku poprzez płukanie i ponowną zawiesinę, aby wygenerować zawieszenie gotowe do transformacji do dostarczania genów do tkanek roślinnych.

Protokół

1. Przygotowanie kultury Agrobacterium do infiltracji

1. Wybierz pozytywną kolonię z płytki Luria-Bertani (LB) i zaszczep komórki w szklanej probówce zawierającej 5 mL medium LB, uzupełnionego 50 μg/mL kanamycyną i 50 μg/mL ryfampicyną. Hoduj komórki w temperaturze 30 °C, potrząsając przy 200 obr./min przez 24−48 godzin.
2. Przelej 100 μL hodowli do 5 mL pożywki LB wzbogaconej tymi samymi antybiotykami, 10 mM kwasu 2-(N-morfolino) etansulfonowego (MES; pH 5,6) oraz 20 μM acetostrykonu (AS). Hodować bakterie w temperaturze 30 °C i potrząsać przy 200 obr./min przez 16−20 godzin.
3. Ogniwa wirówkowe w dawce 4000 x g przez 10 minut. Wylej supernatant i ponownie zawiesij pellet w 2 mL buforu 10 mM MgCl₂ .
4. Powtórz krok 1.3, aby zapewnić całkowite usunięcie antybiotyków.
5. Określ gęstość kultury Agrobacterium , mierząc gęstość optyczną na 600 nm (OD₆₀₀). Ustawiam do OD₆₀₀ 1,5−2,0 z buforem MgCl₂ o pojemności 10 mM.
6. Do końcowych hodowli zawiesin należy dodać 10 mM MES (pH 5,6) i 150 μM AS i inkubować komórki w RT przez co najmniej 3 godziny bez potrząsania.
   UWAGA: Nie zostawiaj ostatnich zawieszeń na noc.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Kwas 2-morfolinoetansulfonowy (MES)	Biofroxx	1086GR500	Bufor
Acetosyringon (AS)	Sigma-Aldrich	D134406-5G	Indukcja Agrobakterii
Agar	Sigma-Aldrich	A1296-1KG	LB medium
Baktotrypton	BD Biosciences	211705	LB medium
Ekstrakcja drożdży bacto	BD Biosciences	212750	LB medium
Siarczan Kanamycyny	Sigma-Aldrich	K1914	Antybiotyki
Ryfampycyna	MP Biomedicals	219549005	Antybiotyki
Chlorek sodu	Amresco	0241-10KG	LB medium