$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały przeanalizowane przez lokalny instytucjonalny komitet ds. opieki nad zwierzętami oraz komisję weterynaryjną JoVE.
1. Inokulacja donośna myszy Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae) hodowana w biofilmie.
- Kup myszy i używaj ich w pożądanym wieku.
UWAGA: Myszy w wieku 3-4 miesięcy są preferowane do modelowania młodych gospodarzy, a myszy w wieku 21-24 miesiące mogą być używane do modelowania osób starszych >65 lat. Dane przedstawione tutaj pochodzą od samców myszy C57BL/6. - Rozmroz biofilmowe aliquoty na lodzie i obróć przy 1 700 × g przez 5 minut. Ostrożnie usuń i wyrzuć supernatant, nie zakłócając granulki, przemyj bakterię przez ponowne zawieszenie pelletu w 1 mL soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS), a następnie ponownie wiruj przy 1 700 × g przez 5 minut. Usuń supernatant i ponownie zawiesij granulat w objętości potrzebnej do osiągnięcia pożądanego stężenia (celuj w 5 × 10 jednostek tworzącychkolonie (CFU)/10 μL do inokulacji donosowej). Potwierdź ilość podanych bakterii, nakładając przygotowane inokulum na płytki z agarem z krwią.
- Zaszczep myszy donosowo 5 × 106 CFU, pipetując 5 μL rozcieńczonego inokulum do każdego naris. Upewnij się, że trzymasz myszy mocno, stabilizując głowę, aż objętość zostanie wciągnięta (zazwyczaj w ciągu kilku sekund od pipetowania objętości do narek). Wykonaj ten krok bez znieczulenia, aby zapobiec zachwyceniu inokulum przez płuca.
2. Zakażenie wirusowe wirusem grypy typu A (IAV)
- Po 48 godzinach po zaszczepieniu donośnym S. pneumoniae rozmroz interesujący szczep IAV na lodzie.
UWAGA: Przedstawione tutaj dane dotyczą podania szczepu wirusa grypy A A/PR/8/34 H1N1 przystosowanego do myszy, który został uzyskany w wyniku wymiany współpracy. - Po rozmrożnięciu wirusa rozcieńcz go w PBS do pożądanego stężenia; celuj w 20 jednostek tworzących płytki nazębne (PFU)/50 μL w przypadku zakażenia śródtchawicowego oraz 200 PFU/10 μL w przypadku zakażenia wewnątrznosowego. W grupach zakażonych pozornie i wyłącznie bakteriami użyj PBS do zaszczepienia myszy.
- Przed znieczuleniem nałóż oczy na oczy myszy smar okulistyczny. Znieczulaj myszy za pomocą izofluranu 5% i potwierdź znieczulenie mocnym uszczypnięciem palca.
- Po znieczuleniu zwierzęcia należy wyjąć je z komory izofluranowej i natychmiast zainfekować znieczulone myszy 50 μL (20 PFU) IAV dotrachealnie, używając tępych pęset, aby wyciągnąć język z jamy ustnej i popichować objętość płynu wzdłuż tchawicy.
- Umieść myszy w osobnej klatce i obserwuj je do całkowitego wyzdrowienia (mogą utrzymać pozycję mostka [mogą leżeć pionowo na klatce piersiowej]).
- Po wyzdrowieniu natychmiast podaj myszy donośnie 10 μL (200 PFU) IAV metodą inokulacji w kroku 1.3.
- Myszy domowe, które przeszły pojedynczą lub podwójną infekcję bakteryjną i wirusową w tej samej grupie i zostały oddzielone od pozostałych grup.