Model myszy do badania patogennej przejścia paciorkowca pneumoniae po współinfekcji wirusowej

Streszczenie

Źródło: Lenhard, A. i in. Model myszy przedstawiający przejście Streptococcus pneumoniae z kolonizatora do patogena po współinfekcji wirusowej powtarza chorobę zaostrzoną przez wiek. J. Vis. Exp. (2022)

Ten film pokazuje model współinfekcji myszy, w którym wirus grypy wywołuje przejście Streptococcus pneumoniae z kolonizatora do patogenu. Opisuje etapy związane z kolonizacją bakteryjną, infekcją wirusową i postępem choroby.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały przeanalizowane przez lokalny instytucjonalny komitet ds. opieki nad zwierzętami oraz komisję weterynaryjną JoVE.

1. Inokulacja donośna myszy Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae) hodowana w biofilmie.

1. Kup myszy i używaj ich w pożądanym wieku.
   UWAGA: Myszy w wieku 3-4 miesięcy są preferowane do modelowania młodych gospodarzy, a myszy w wieku 21-24 miesiące mogą być używane do modelowania osób starszych >65 lat. Dane przedstawione tutaj pochodzą od samców myszy C57BL/6.
2. Rozmroz biofilmowe aliquoty na lodzie i obróć przy 1 700 × g przez 5 minut. Ostrożnie usuń i wyrzuć supernatant, nie zakłócając granulki, przemyj bakterię przez ponowne zawieszenie pelletu w 1 mL soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS), a następnie ponownie wiruj przy 1 700 × g przez 5 minut. Usuń supernatant i ponownie zawiesij granulat w objętości potrzebnej do osiągnięcia pożądanego stężenia (celuj w 5 × 10 jednostek tworzących^kolonie (CFU)/10 μL do inokulacji donosowej). Potwierdź ilość podanych bakterii, nakładając przygotowane inokulum na płytki z agarem z krwią.
3. Zaszczep myszy donosowo 5 × 10⁶ CFU, pipetując 5 μL rozcieńczonego inokulum do każdego naris. Upewnij się, że trzymasz myszy mocno, stabilizując głowę, aż objętość zostanie wciągnięta (zazwyczaj w ciągu kilku sekund od pipetowania objętości do narek). Wykonaj ten krok bez znieczulenia, aby zapobiec zachwyceniu inokulum przez płuca.

2. Zakażenie wirusowe wirusem grypy typu A (IAV)

1. Po 48 godzinach po zaszczepieniu donośnym S. pneumoniae rozmroz interesujący szczep IAV na lodzie.
   UWAGA: Przedstawione tutaj dane dotyczą podania szczepu wirusa grypy A A/PR/8/34 H1N1 przystosowanego do myszy, który został uzyskany w wyniku wymiany współpracy.
2. Po rozmrożnięciu wirusa rozcieńcz go w PBS do pożądanego stężenia; celuj w 20 jednostek tworzących płytki nazębne (PFU)/50 μL w przypadku zakażenia śródtchawicowego oraz 200 PFU/10 μL w przypadku zakażenia wewnątrznosowego. W grupach zakażonych pozornie i wyłącznie bakteriami użyj PBS do zaszczepienia myszy.
3. Przed znieczuleniem nałóż oczy na oczy myszy smar okulistyczny. Znieczulaj myszy za pomocą izofluranu 5% i potwierdź znieczulenie mocnym uszczypnięciem palca.
4. Po znieczuleniu zwierzęcia należy wyjąć je z komory izofluranowej i natychmiast zainfekować znieczulone myszy 50 μL (20 PFU) IAV dotrachealnie, używając tępych pęset, aby wyciągnąć język z jamy ustnej i popichować objętość płynu wzdłuż tchawicy.
5. Umieść myszy w osobnej klatce i obserwuj je do całkowitego wyzdrowienia (mogą utrzymać pozycję mostka [mogą leżeć pionowo na klatce piersiowej]).
6. Po wyzdrowieniu natychmiast podaj myszy donośnie 10 μL (200 PFU) IAV metodą inokulacji w kroku 1.3.
7. Myszy domowe, które przeszły pojedynczą lub podwójną infekcję bakteryjną i wirusową w tej samej grupie i zostały oddzielone od pozostałych grup.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Kwas 4-aminobenzoowy	Fisher	AAA1267318	Mieszanka I
Filtry 100 μm	Fisher	07-201-432
Rurki polietylenowe BD intramedyczne	Fisher	427410	Rurki do płukania nosa
Jednorazowe strzykawki BD z końcówkami Luer-Lok (1 mL)	Fisher	14-823-30
D39	Narodowa Kolekcja Kultury Typowej (NCTC)	NCTC 7466	Szczep Streptococcus pneumoniae
Pivetal Isoflurane	Weterynaria Patterson	07-893-8440	Izofluran do znieczulenia podczas infekcji
Thermo Scientific Blood Agar z gentamicyną	Fisher	R01227	Płytki agarowe krwi z antybiotykiem gentamicyną
TIGR4	ATCC	BAA-334	Szczep Streptococcus pneumoniae