Protokół dla rekombinowanych szczepionek przeciwko SARS opartych na RBD: przygotowanie białka, szczepienie zwierząt i detekcja neutralizacji

Podsumowanie

Niniejszy protokół opisuje ogólną procedurę badania subunitowych szczepionek opartych na rekombinowanym domenie wiążącej receptor (RBD) przeciwko SARS. Obejmuje on metody transfekcji i ekspresji białka RBD w komórkach 293T, immunizację myszy białkiem RBD oraz wykrywanie aktywności neutralizacji w surowicach mysich przy użyciu uznanego testu neutralizacji pseudowirusa SARS.

Streszczenie

Ze względu na swój profil bezpieczeństwa oraz zdolność do indukowania silnych odpowiedzi immunologicznych przeciwko infekcjom, szczepionki podjednostkowe są stosowane jako kandydaty do walki z szerokim spektrum patogenów ^1-3. Ponieważ system komórek ssaków umożliwia modyfikacje potranslacyjne, tworząc w ten sposób prawidłowo sfałdowane i glikozylowane białka, białka rekombinowane ekspresowane w komórkach ssaków wykazują największy potencjał w zakresie zachowania wysokiej antygenowości i immunogenności ^4-6.

Choć od 2004 roku nie zgłoszono nowych przypadków SARS, przyszłe ogniska choroby stanowią stałe zagrożenie; dlatego opracowanie szczepionek przeciwko SARS-CoV jest rozważnym krokiem zapobiegawczym i powinno zostać zrealizowane. Domena RBD białka S SARS-CoV odgrywa istotną rolę w wiązaniu receptorów i indukcji specyficznych przeciwciał neutralizujących przeciwko infekcji wirusowej ^7-9. W związku z tym w niniejszym protokole opisujemy nowe metody opracowania podjednostkowej szczepionki opartej na RBD przeciwko SARS. W skrócie, rekombinowane białko RBD (rRBD) wyekspresowano w supernatancie hodowlanym ssaczych komórek 293T, aby uzyskać prawidłowo sfałdowane białko o odpowiedniej konformacji i wysokiej immunogenności ⁶. Transfekcję komórek rekombinowanym plazmidem kodującym RBD przeprowadzono następnie metodą transfekcji fosforanem wapnia ^6,10 z pewnymi modyfikacjami. W porównaniu z metodą transfekcji lipidowej ^11,12, ta zmodyfikowana metoda transfekcji fosforanem wapnia jest tańsza, łatwiejsza w obsłudze i ma potencjał do osiągnięcia wysokiej wydajności po uformowaniu kompleksu transfekcyjnego o odpowiednim rozmiarze i kształcie ^13,14. Na koniec w protokole wprowadzono test neutralizacji pseudowirusa SARS, który wykorzystano do wykrycia aktywności neutralizującej w surowicach myszy zaszczepionych białkiem rRBD. Test ten jest stosunkowo bezpieczny, nie wymaga użycia zakaźnego SARS-CoV i może być przeprowadzany bez konieczności posiadania laboratorium poziomu bezpieczeństwa biologicznego 3 (BSL-3) ¹⁵.

Opisany tutaj protokół może być również wykorzystany do projektowania i badania rekombinowanych szczepionek podjednostkowych przeciwko innym wirusom z białkami fuzyjnymi klasy I, na przykład HIV, wirusowi RSV, wirusowi Ebola, wirusowi grypy, a także wirusom Nipah i Hendra. Ponadto metody generowania pseudowirusa i następującego po tym opracowania testu neutralizacji pseudowirusa można zastosować w odniesieniu do wszystkich tych wirusów.

Protokół

1. Przygotowanie rekombinowanego białka RBD SARS-CoV

1. Przygotowanie odczynnika do transfekcji fosforanem wapnia
   1. Przygotowanie buforu 2X HBS: Wymieszać 16 g NaCl, 0,4 g Na₂HPO₄*7H₂O oraz 13,0 g HEPES. Dostosować pH do wartości 7,00 i uzupełnić objętość do 1000 mL wodą destylowaną. Po przefiltrowaniu roztworu w celu sterylizacji, rozdzielić na alikwoty i przechowywać w temperaturze -20°C.
      Wskazówka: Każda zmiana wartości pH może wpłynąć na wyniki transfekcji. Dlatego zaleca się przetestowanie kilku wartości pH w okolicy 7,00 (na przykład 6,99, 7,00 lub 7,01) i wybranie optymalnej dla transfekcji przy użyciu metody opisanej poniżej.
   2. Przygotowanie 2,5 M CaCl₂: Dodać 73,5 g CaCl₂*2H₂O do wody destylowanej do uzyskania końcowej objętości 200 mL. Przefiltrować roztwór i przechowywać w temperaturze -20°C.
2. Transfekcja plazmidem rekombinowanym i oczyszczanie białka
   1. Przeszczepić komórki 293T przy konfluencji 50-70% na 24 h przed transfekcją. Hodować komórki w kolbach do hodowli tkankowych T-175 cm² w 40 mL DMEM zawierającego 10% inaktywowanej ciepłem (HI) FBS oraz 1% penicyliny/streptomycyny (P/S) w temperaturze 37°C w 5% CO₂.
   2. Wszystkie odczynniki do transfekcji powinny zostać doprowadzone do temperatury pokojowej przed zabiegiem. Odczynniki te obejmują 2X HBS, 2,5M CaCl₂, DiH₂O oraz plazmid rRBD ⁶.
      Wskazówka: Końcowy konstrukt plazmidu rekombinowanego użyty do ekspresji białka powinien zawierać peptyd sygnałowy, aby zapewnić sekrecję ekspresowanych białek rekombinowanych do nadsączu hodowli. Do końca C-końca ekspresowanego białka można dodać znacznik 6x His w celu ułatwienia oczyszczania.
   3. Przygotować jedną probówkę BD Falcon 50 mL (A) i jedną 15 mL (B), a następnie dodać odczynniki do probówek zgodnie z Tabelą 1. Do probówki A dodać bufor 2X HBS. Do probówki B dodać 2,5M CaCl₂ oraz plazmid rRBD, a następnie uzupełnić objętość do wymaganej wartości za pomocą DiH₂O.
      

      A. Jedna kolba do hodowli tkankowych T-175 cm2 (4000 μL/kolba): przygotowanie do ekspresji rRBD
      Probówka A		Probówka B
      2X HBS	2000 μL	2,5M CaCl2	200 μL
      		DNA plazmidu rRBD	40 μg
      		DiH2O do	2000 μL
      B. Jedna szalka Petriego 100-mm (1000 μL/szalka): przygotowanie do produkcji pseudowirusa SARS
      Probówka A		Probówka B
      2X HBS	500 μL	2,5M CaCl2	50 μL
      		DNA plazmidu SARS-CoV S	5 μg
      		plazmid HIV-1 (pNL4-3.luc.RE)	5 μg
      		DiH2O do	500 μL

      Tabela 1. Przygotowanie i objętości mieszaniny do transfekcji
      Objętości wymienione w Tabeli 1 dotyczą jednej jednostki transfekcji. W przypadku użycia większej liczby kolb lub szalek do transfekcji, należy odpowiednio dostosować objętości.
   4. Roztwór DNA-wapnia z probówki B dodawać kroplami do probówki A, utrzymując stałe i łagodne mieszanie w wortexie. Pozostawić mieszaninę w temperaturze pokojowej na 20-30 min. Kluczem do udanej transfekcji fosforanem wapnia jest wielkość i kształt powstałego osadu. Dlatego mieszaninę należy wortexować stale i powoli, aby spełnić ten wymóg i w rezultacie zwiększyć wydajność transfekcji.
   5. Mieszaninę dodawać kroplami i równomiernie do komórek 293T (4000 μL/kolba). Hodować komórki w inkubatorze w temperaturze 37°C w 5% CO₂.
   6. Wymienić pożywkę hodowlaną na świeżą, bezzsyłkową pożywkę OPTI-MEM I Reduced-Serum Medium (50 mL/kolba) 8-10 h po transfekcji. Kontynuować hodowlę komórek przez kolejne dwa dni w tych samych warunkach.
   7. Zebrać nadsącz zawierający ekspresowane białko rRBD 72 h po transfekcji. Odwirować przy 6000 obr./min przez 15 min, aby usunąć debris komórkowy. Do zebranego nadsączu dodać koktajl inhibitorów proteaz i przechowywać w temperaturze 4°C przez noc.
   8. Następnego dnia oczyścić rekombinowane białko rRBD z nadsączu hodowlanego przy użyciu Ni-NTA Superflow zgodnie z instrukcjami producenta.
   9. Skoncentrować oczyszczone białko za pomocą probówek koncentrujących Amicon Ultra -15. Po koncentracji białka dodać PBS do probówek koncentrujących i ponownie odwirować, aby usunąć imidazol z buforu elucyjnego. Obliczyć stężenie białka i przechowywać oczyszczone białko w temperaturze -80°C do czasu użycia.

2. Immunizacja myszy i pobieranie próbek

1. Podgrzać system adiuwantowy Sigma (SAS) do 40-45°C zgodnie z instrukcjami producenta. Dodać 1 mL PBS do każdej fiolki i dokładnie wymieszać.
2. Przygotować emulsję białko-adiuwant zgodnie z protokołem zamieszczonym w Tabeli 2. Odmierzyć pipetą obliczoną ilość białka rRBD do probówki o pojemności 1,5 mL. Dodać do probówki taką samą objętość adiuwantu SAS i intensywnie mieszać w wortexie przez 2-3 min w celu utworzenia emulsji.
   Wskazówka: Objętości wymienione w Tabeli 2 dotyczą jednej myszy. Dostosować objętości do rzeczywistej liczby użytych myszy. Dla każdej grupy wymieszać białka i adiuwant wymagane dla każdej szczepionki. Zawsze przygotowywać jedną dodatkową próbkę do szczepienia, aby zapewnić dokładność.
   

   Grupa	1a szczepionka (200 μL/mysz)	2a szczepionka (200 μL/mysz)	3a szczepionka (200 μL/mysz)
   białko rRBD	20 μg białka w PBS (100 μL) + 100 μL SAS	10 μg białka w PBS (100 μL) + 100 μL SAS	10 μg białka w PBS (100 μL) + 100 μL SAS
   kontrola PBS	100 μL PBS + 100 μL SAS	100 μL PBS + 100 μL SAS	100 μL PBS + 100 μL SAS

   Tabela 2. Protokół immunizacji myszy
3. Przeprowadzić pierwszą immunizację podskórną samic myszy BALB/c (w wieku 4-6 tygodni, 5 myszy/grupa), a następnie dwukrotnie podać dawkę przypominającą z rRBD i SAS, jak wskazano w Tabeli 2. Grupę PBS stosować jako kontrolę. Jako miejsce wstrzyknięć podskórnych zazwyczaj wybiera się luźną skórę między łopatkami. Alternatywnie często stosuje się brzuszną stronę brzucha, ponieważ ułatwia to iniekcję i pozwala zaobserwować ewentualne wycieki z miejsc wstrzyknięcia. Przy stosowaniu powtarzających się dawek szczepionek łatwo jest wybierać różne miejsca wstrzyknięcia, co zapobiega potencjalnym miejscowym reakcjom skórnym.
4. Pobrać krew z myszy metodą zatocza zakrzepowego w znieczuleniu przed immunizacją oraz 10 dni po każdym szczepieniu; naświetlać surowice w temperaturze 56°C przez 30 min w celu inaktywacji dopełniacza. Przechowywać surowice mysie w temperaturze -20°C do czasu użycia.

3. Wykrywanie neutralizacji przy użyciu testu neutralizacji pseudowirusów

1. Przygotowanie pseudowirusa SARS
   1. Przesiej komórki 293T do 100 mm szalek hodowlanych (2x10⁶ komórek/szalka) 16 h przed transfekcją i hoduj komórki zgodnie z powyższymi instrukcjami.
   2. Przygotuj odczynniki do transfekcji zgodnie z Tabelą 1. Przeprowadź kotransfekcję plazmidu kodującego białko S SARS-CoV oraz plazmidu kodującego genom HIV-1 z defektem białka Env, wykazującego ekspresję lucyferazy (pNL4-3.luc.RE), przy użyciu odczynnika do transfekcji z fosforanu wapnia.
   3. Wymień medium na 10 mL świeżego DMEM zawierającego 10% FBS i 1% P/S 8-10 h po transfekcji. Zbierz nadsącz zawierający pseudowirusa SARS 72 h po transfekcji.
   4. Przefiltruj pseudowirusa przez filtr 0,45 μm. Podziel na aliquoty i przechowuj w temperaturze -80°C do momentu użycia.
2. Test neutralizacji pseudowirusa SARS
   1. Przesiej komórki 293T wykazujące ekspresję receptora ACE2 SARS-CoV (ACE2/293T) w zagęszczeniu 10⁴ komórek/100 μL/studzienkę w 96-dołkowych płytkach hodowlanych 16 h przed infekcją.
   2. Rozcieńcz pseudowirusa SARS dwukrotnie, aby oznaczyć miano wirusa w komórkach ACE2/293T.
   3. Wykonaj rozcieńczenia seryjne surowic mysich w 96-dołkowych płytkach hodowlanych i dodaj równą objętość mianowanego pseudowirusa SARS. Inkubuj płytki w temperaturze 37°C przez 1 h.
   4. Po inkubacji dodaj 100 μL mieszaniny surowica-pseudowirus do komórek ACE2/293T i kontynuuj hodowlę komórek w temperaturze 37°C w 5% CO₂. Po 24 h dodaj świeże DMEM.
   5. Całkowicie usuń nadsącze hodowlane z płytek 72 h po infekcji. Dodaj 1X odczynnik do lizy komórek w hodowli dla lucyferazy (60 μL/studzienkę) i przeprowadź lizę komórek poprzez ciągłe wstrząsanie płytek przez 1-2 h w temperaturze pokojowej.
   6. Przenieś lizaty komórkowe (50 μL/studzienkę) do płytek do luminometru (96-dołkowe płytki Microfluor). Dodaj substrat lucyferazy (50 μL/studzienkę) dołączony do zestawu testowego lucyferazy i zmierz względną aktywność lucyferazy w luminometrze Ultra 384.
   7. Oblicz miano neutralizacji pseudowirusa SARS i przedstaw jako miano przeciwciał neutralizujących 50% (NT₅₀) ⁶.

Dyskusja

Gęstość komórek jest istotnym czynnikiem wpływającym na skuteczność transfekcji opartej na fosforanie wapnia. Z naszego doświadczenia wynika, że najlepsze wyniki uzyskuje się przy konfluencji komórek poniżej 70%. Aby zatem zwiększyć wydajność transfekcji, zaleca się utrzymanie gęstości komórek na poziomie około 50-70% konfluencji. Metoda transfekcji fosforanem wapnia jest zazwyczaj uważana za mniej wydajną w porównaniu z innymi metodami, takimi jak transfekcja lipidowa ¹⁶. W niniejszym protokole zastosowano jednak zmodyfikowaną metodę transfekcji fosforanem wapnia, w której stałe i powolne mieszanie roztworu transfekcyjnego za pomocą voreksu zapewnia powstanie osadu o odpowiedniej wielkości i kształcie, co zwiększa wydajność transfekcji.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653
Na2HPO4*7H2O	Sigma-Aldrich	S2429
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
CaCl2*2H2O	Sigma-Aldrich	C5080
DMEM	Invitrogen	12430
HI FBS	Invitrogen	10438
Penicylina/Streptomycyna	Invitrogen	15140
Pożywka OPTI-MEM I	Invitrogen	31985
Koktajl inhibitorów proteaz	Roche Group	11836170001
Ni-NTA Superflow	Qiagen	30450
System adiuwantowy Sigma	Sigma-Aldrich	S6322
System do analizy lucyferazy	Promega Corp.	E1501
Odczynnik do lizy kultur komórkowych lucyferazy (5X)	Promega Corp.	E1531
Amicon Ultra - 15	EMD Millipore	UFC901024
Płytki Microfluor 96-dołkowe	Thermo Fisher Scientific, Inc.	7905
Luminometr Ultra 384	Tecan Group Ltd.