Przygotowanie kolonii biofilmu bakteryjnego do analizy morfologicznej

Streszczenie

Źródło: Bucher, T. i in., Metodologie badań biofilmów B. subtilis jako modelu do charakteryzacji inhibitorów biofilmu małocząsteczkowego. J. Vis. Exp.(2016)

Ten film pokazuje przygotowanie dojrzałych kolonii biofilmu bakteryjnego do obrazowania w wysokiej rozdzielczości. Obejmuje etapy utrwalania, odwodnienia, montażu oraz nakładania powłok metalowych, aby zachować i zobrazować morfologię biofilmu.

Protokół

Przygotowanie próbki kolonii biofilmu do skaningowej mikroskopii elektronowej

1. Hodować kolonie bakteryjnego biofilmu.
2. Przygotuj świeżą partię 2% (v/v) glutaraldehydu, 3% (v/v) roztworu paraformaldehydu w 100 mM kakodylatu sodu, 5 mM buforu chlorku wapnia, pH 7,3. Przygotuj 5 ml utrwalacza na każdą szalkę Petriego o średnicy 8,5 cm.
   UWAGA: Glutaraldehyd i paraformaldehyd są niebezpieczne. Obchodz się z nimi za pomocą sprzętu zabezpieczającego w okapie chemicznym. Usuwać roztwory i zanieczyszczone materiały w odpadach niebezpiecznych.
3. Ostrożnie dodaj utrwalacz do kolonii biofilmu, nie nakładając bezpośrednio na biofilmy.
   UWAGA: Ze względu na hydrofobowy charakter kolonii biofilmowej, kolonie powoli odłączają się od agaru i zaczynają unosić się na powierzchni.
4. Ostrożnie uszczelnij płytki paskiem Parafilm. Inkubuj na obrotowym shakerze przez 2 godziny w temperaturze pokojowej, a następnie przenieś płytki do 4 °C przez noc.
5. Następnego dnia ostrożnie usuń płyn pipetą Pasteura podłączoną do pompy próżniowej.
6. Ostrożnie dodaj 10 ml 100 mM kakodylanu sodu, 5 mM buforu chlorku wapnia, aby przepłukać biofilm i inkubować przez 5 minut. Delikatnie usuń płyn pipetą szklaną Pasteur z rogu talerza, aby nie uszkodzić biofilmu, i dodaj świeży roztwór do mycia delikatnym pipetowaniem. Powtórz ten krok raz.
7. Aby odwodnić kolonie biofilmu, należy wykonać następujące kroki: 2x 5 min w ddH_2O; 2x 20 minut w 30% etanolu; 2x 20 minut w 50% etanolu; 2x 20 minut w 70% etanolu; 2x 20 minut w 96% etanolu; 2x 30 minut w 100% etanolu.
   1. Na każdy etap dodaj 15 ml płynu na każdą szalkę Petriego o średnicy 8,5 cm i ostrożnie usuwaj płyn po każdej inkubacji.
8. Stosuj jedną z dwóch różnych metod suszenia próbek z etanolu.
   1. Do suszenia na powietrzu po etanolu:
      1. Potnij papier filtracyjny celulozowy (średnica 9 cm) na ćwiartki. Krótko zanurz jedną czwartą w 100% etanolu, a następnie ostrożnie przełóż na nią jedną unoszącą się kolonię biofilmu. Włóż mokry papier filtracyjny do szalki Petriego, wyłożonej papierem filtracyjnym. Przykryj szalkę Petriego i pozwól koloniom biofilmu wyschnąć przez noc w okapu chemicznym.
9. Ołóż fragment mikroskopii elektronowej taśmą węglową. Z pomocą pęsety ostrożnie przenieś kolonie biofilmu na końcówkę. Każdą kolonię połącz z odcinkiem, dodając cienki mostek z taśmy węglowej, co jest kluczowe dla eliminacji ładunku pod wiązką elektronów. Na tym etapie należy ostrożnie obchodzić się z koloniami biofilmu, ponieważ są bardzo delikatne. Przechowuj próbki w osuszacu przez co najmniej 24 godziny lub do czasu badania.
10. W dniu badania, za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego (SEM), pokryj kolonie biofilmu przez 2 minuty pod kątem 60° w warstwie sputter-coater ze złotem i palladem. Powtórz ten krok dwa razy i obróć próbki o 120° pomiędzy nimi. Na końcu nałóż próbki na 3 minuty na powierzchnię przez 3 minuty. Cienka warstwa złota-palladu o długości 20 nm poprawia przewodność i zwiększa kontrast próbki do obrazowania w skaningowej mikroskopii elektronowej.
11. Przechowuj próbki w osuszaczu, aby uniknąć jej ponownego nawodnienia aż do wykonania obrazowania za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Glicerol bezwodny	Bio-Lab Itp	712022300
Bezwodny etanol	Gadot	830000054
Żyletka	Eddison	NA
Okrągłe papiery filtrujące celulozę	Co, 90 mm	1001-090
Glutaraldehyd	EMS (Elektronon Micoscopy Science), 25% w wodzie	16220
Paraformaldehyd	EMS, 16% w wodzie	15710
Kakodylan sodu	Merck, 214,05 g/mol	8.2067
Chlorek wapnia 2-hydrat	Merck, 147,02 g/mol	1172113
Montaż aluminiowy z zastępczego	EMS, głowica szczelinowa	75230
Taśma klejąca węglowa	EMS	77825-12
Wstrząs 37 °C	New Brunswick Scientific Innowa42	NA
Inkubator 30 °C	Segregator	NA
Inkubator 23 °C	Segregator	NA
Rotacyjny wstrząs - Orbitron Rotatory II	Boekel	NA
Powłoka S150 Spraya Roztrzęsienia	Edwards	NA
Środowiskowy skaningowy mikroskop elektronowy	XL30 ESEM FEG Philips (FEI)	NA