Opracowywanie bakteryjnego monowarstwowego biofilmu z użyciem reaktora elektrochemicznego

Streszczenie

Źródło: Tokunou, Y . i in., Elektrochemiczne wykrywanie efektu izotopu kinetycznego deuteru na transport elektronów zewnątrzkomórkowych w Shewanella oneidensis MR-1. J. Vis. Exp. (2018)

Ten film demonstruje montaż i działanie modelu reaktora elektrochemicznego zaprojektowanego do symulacji powstawania biofilmu na powierzchniach elektrod. Kontrolowana stymulacja elektrochemiczna sprzyja przyczepności mikroorganizmów, prowadząc do stopniowego powstawania bakteryjnego monowarstwowego biofilmu.

Protokół

1. Budowa reaktora elektrochemicznego z trzema elektrodami (Rysunek 1)
   1. Na dnie reaktora umieść podłoże domieszkowane tlenkiem indu cyną (ITO) jako elektrodę roboczą.
   2. Następnie włóż szklany cylinder (średnica 2 cm) oraz pokrywę z politetrafluoroetylenu (PTFE). Następnie do reaktora włożono chlorek srebra/srebra (Ag/AgCl) (chlorek potasu, nasycony KCl) oraz drut platynowy odpowiednio jako elektrody odniesienia i kontra.
      UWAGA: Aby zapobiec wycieku powietrza i roztworu, włóż folię z gumy butylowej między każdy element.
   3. Do reaktora elektrochemicznego dodaj 4,0 mL zdefiniowanego medium (DM) wzbogaconego o 10 mM mleczanu i 0,5 g/l ekstraktu drożdżowego.
   4. Po potwierdzeniu, że nie ma wycieku z reaktora elektrochemicznego, należy wprowadzić gaz azotowy do reaktora elektrochemicznego przez ponad 20 minut, aby utrzymać warunki beztlenowe wewnątrz reaktora elektrochemicznego.
      UWAGA: Aby zapobiec skażeniu innymi mikroorganizmami, gaz powinien być przefiltrowany przed wejściem do reaktora elektrochemicznego.
   5. Podłącz reaktor elektrochemiczny do potencjostatu i przyłóż +0,4 V (w porównaniu do standardowej elektrody wodorowej SHE) do elektrody ITO, utrzymując temperaturę reaktora elektrochemicznego na poziomie 30 °C przy użyciu zewnętrznego systemu cyrkulacji wody.
      UWAGA: Aby zapobiec działaniu zewnętrznego pola elektrycznego, reaktor elektrochemiczny powinien być umieszczony w klatce Faradaya.
2. Elektrochemiczna uprawa ogniw MR-1 S. oneidensis (Rysunek 1 i Rysunek 2)
   1. Dostosuj gęstość komórek zawiesiny uzyskanej w kroku 1.1 do gęstości optycznej 1,43 przy 600 nm (OD₆₀₀) z dodatkiem DM o 10 mM mleczanu i 0,5 g/l ekstraktu drożdży.
      UWAGA: Aby uzyskać poprawny OD₆₀₀, należy zastosować zawiesinę ogniwa_{OD 600} ≤ 0,8 do spektrometru UV-vis przed dostosowaniem OD₆₀₀ do 1,43.
   2. Dodaj 0,3 mL zawiesiny ogniwa do reaktora elektrochemicznego przez port wtryskowy za pomocą strzykawki: OD₆₀₀ w reaktorze zmienia się na 0,1.
      UWAGA: Dodanie zawiesiny ogniwa 0,3 mL z OD₆₀₀ = 1,43 do reaktora elektrochemicznego zawierającego medium 4,0 mL skutkuje uzyskaniem 4,3 mL roztworu o stężeniu OD₆₀₀ = 0,1. Przy użyciu innych reaktorów o różnych objętościach konieczne jest obliczenie gęstości ogniwa.
   3. Kontynuuj aplikację potencjału na elektrodzie ITO przy +0,4 V (w przeciwieństwie do SHE) przez 25 godzin.
      UWAGA: Aby utworzyć monowarstwowy biofilm na elektrodzie ITO, należy upewnić się, że wytworzony prąd wykazuje odchylenie mniejsze niż 50% od Rysunku 2.

Wyniki

Rysunek 1: Reaktor elektrochemiczny używany w tym badaniu. Zdjęcie ogniwa elektrochemicznego przed budową (a) i po wykonaniu (b). (c) Schematyczna ilustracja reaktora elektrochemicznego po 25 godzinach inokulacji elektrochemicznej przy +0,4 V względem S...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Cylinder szklany	Nie ma	Nie ma	Wykonany na zamówienie, używany jako reaktor elektrochemiczny
Osłona i podstawa PTFE	Nie ma	Nie ma	Wykonany na zamówienie, używany jako osłona i fundament reaktora elektrochemicznego
Guma Buthyl	Nie ma	Nie ma	Wykonana na zamówienie, wstawiona pomiędzy każdy komponent reaktora elektrochemicznego
Septa	GL Science	3007-16101	Wykorzystywany jako port wtryskowy reaktora elektrochemicznego
Elektroda tlenku indu i cyny (ITO)	GEOMATEC	Nr 0001	Używany jako elektroda robocza, 5Ω/sq
Elektroda nasycona Ag/AgCl KCl	HOKUTO DENKO	HX-R5	Używany jako elektroda referencyjna, Φ0,30mm
Drut platynowy	Kooperacja Nilaco	PT-351325	Używany jako elektroda przeciwdziałająca
Luria-Bertani (LB) Broth, Miller	Becton, Dichkinson and Company	244620	Podłoże do wstępnej hodowli S. oneidensis MR-1
Bacto agar	Becton, Dichkinson and Company	214010
NaHCO₃	Wako	191-01305	Używane dla zdefiniowanego medium (DM)
CaCl₂·2H₂O	Wako	031-00435	Używane do DM
NH₄Cl	Wako	011-03015	Używane do DM
MgCl₂·6H₂O	Wako	135-00165	Używane do DM
NaCl	Wako	191-01665	Używane do DM
2-[4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynylo] kwas etynosulfonowy (HEPES)	DOJINDO	346-08235	Używane do DM
Roztwór mleczanu sodu	Wako	195-02305
Ekstrakt z drożdży bacto	Becton, Dichkinson and Company	212750
Tlenek deuteru (D, 99,9%)	Cambridge Izotope Laboratories, Inc.	DLM-4-PK	Addytywa do eksperymentów z efektem izotopowym kinetycznym
Inkubator	TOKIJSKA SPÓŁKA RIKAKIKAI LTD.	LTI-601SD	Wykorzystywane do preuprawy
Shaker	TAITEC	NR-3	Wykorzystywane do preuprawy
Maszyna autoklawowa	TOMY SEIKO CO. LTD.	LSX-500	Używany do sterylizacji reaktora elektrochemicznego i medium
Czysta ławka	SANYO	MCV-91BNF	Stosowany do zapobiegania skażeniu reaktora elektrochemicznego i ośrodka innymi mikroorganizmami
Separator wirówkowy	Eppendorf	5430R	Wymagana jest prędkość obrotowa do 6000×g
Generator gazu azotowego	Puequ CO. LTD.	PNTN-2	Zamiast generatora gazowego można również używać butli gazowej z azotem
Spektrometr UV-vis	SHIMADZU	UV-1800	Wykorzystywane do optymalizacji gęstości komórek
Potencjostat	BioLogic	VMP3	Wykorzystywane do tworzenia biofilmu oraz eksperymentów z efektem izotopowym kinetycznym
Cyrkulator wody termalnej	JAKO JEDNO	TR-1A	Wykorzystywane do utrzymania temperatury reaktora elektrochemicznego
Klatka Faradaya	HOKUTO DENKO	HS-201S	Wykorzystywane do eksperymentów elektrochemicznych