Ustanowienie mysiego modelu infekcji Clostridium difficile

Streszczenie

Źródło: Winston, J. A. i in. Model myszy leczonem cefoperazonu klinicznie istotnego szczepu Clostridium difficile R20291. J. Vis. Exp. (2016)

Ten film pokazuje procedurę szczepienia myszy wcześniej leczonymi antybiotykiem zarodnikami Clostridium difficile , aby ustanowić model infekcji myszy do badania patogenezy i odpowiedzi gospodarza.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały przeanalizowane przez lokalny instytucjonalny komitet ds. opieki nad zwierzętami oraz komisję weterynaryjną JoVE.

1. Przygotowanie inokulum zarodników Clostridium difficile oraz doustnego gawu myszy

UWAGA: Myszy z zarodnikami C. difficile powinny być przechowywane w ośrodku zwierzęcym o poziomie biobezpieczeństwa 2.

1. Uzyskanie zapasu zarodników C. difficile o pożądanym szczepie (w tym przypadku R20291), który został przygotowany i przechowywany w temperaturze 4 °C w wodzie sterylnej. Przed użyciem należy ustalić listę tego zarodnika.
2. Na podstawie znanego stężenia (zarodników/ml) zapasu zarodników oblicz pożądane rozcieńczenie, aby uzyskać 10⁵ zarodników na 25 μl. Upewnij się, że objętość inokulum jest wystarczająca, aby zaszczepić wszystkie myszy w eksperymencie (25 μl na mysz), przeprowadzić wyliczenie inokulum (około 30 μl) oraz uwzględnić błąd pipetowania.
3. Vortex, oryginalny materiał zarodnikowy C. difficile . Następnie ponownie zawiesz obliczoną objętość (od kroku 1.2) oryginalnego zapasu zarodników C. difficile w wodzie sterylnej w rurce mikrowirówki z zakrętką śrubkową. Wykonuj to aerobnie w kapturze laminarnym przepływem. Zidentyfikowaj tę rozcieńczoną mieszankę jako "inokulum zarodnika".
4. Włóż inokulum zarodników do kąpieli wodnej o temperaturze 65 °C i podgrzej je przez 20 minut.
   UWAGA: Ten krok zapewni, że po zabiegu termicznym pozostaną tylko aktywne zarodniki C. difficile .
5. W okapie laminarnym weź 50 μl podgrzanego inokulum zarodników, umieść je w sterylnej rurce mikrowirówki i przepuść do komory beztlenowej. Użyj tego przykładu do wyliczania zarodników.
6. Wewnątrz laminarnego kaptura załaduj pozostałe podgrzane inokulum zarodników do strzykawki o wartości 1 ml podłączonej do sterylnej igły żołądkowej z końcówką żołądka. Korzystaj z ręcznego kroka strzykawkowego, aby zapewnić dokładne i szybkie powtarzanie dawkowania między myszymi. Upewnij się, że igła gavage jest wypełniona podgrzanym inokulum zarodników przed użyciem.
   UWAGA: Nie jest wymagana nowa sterylna igła gavage dla każdej myszy. Jednak jeśli podane są różne dawki zarodników C. difficile , zaleca się nową igłę gavage przy każdej dawce.
   UWAGA: Zarodniki C. difficile są bardzo odporne na tradycyjne środki dezynfekujące. Dlatego konieczne jest użycie środka dezynfekującego sporicydalnego, takiego jak #62 Perisept Sporicidal Disinfectant. Producent zaleca 2-minutowy kontakt na zniszczenie zarodników C. difficile .
7. Przełóż każdą mysz 25 μl inokulum zarodnika. Delikatnie unieruchom każdą mysz, chwytając zwierzę za luźną skórę szyi i pleców, aby unieruchomić głowę. Użycie palca wskazującego dodatkowo unieruchamia głowę zwierzęcia i wydłuża przełyk. Upewnij się, że zwierzę nie wydaje dźwięków ani nie wykazuje innych oznak stresu podczas unieruchamiania.
   UWAGA: Całkowita objętość przekazywana myszom przez gavage nie powinna przekraczać 10 ml/kg masy ciała (0,1 ml/10 g).
8. Utrzymuj mysz w pionowej, pionowej pozycji i delikatnie włóż igłę gavage do boku pyska. Skieruj igłę gavage wzdłuż podniebienia i powoli przesuwaj igłę gavage do przełyku.
   UWAGA: Jeśli napotkamy opór, igła gavage może wchodzić do tchawicy i dlatego NIE powinna być przesuwana, lecz natychmiast usuwana i przesuwana.
9. Gdy igła gavage znajduje się mniej więcej w połowie przełyku, wstrzykni 25 μl podgrzanego inokulum zarodnika i delikatnie wyjmij igłę gavage z przełyku.
   UWAGA: Siłowne wysuwanie igły gavage może prowadzić do pęknięcia przełyku lub żołądka. Dlatego jeśli napotkamy opór podczas przesuwania igły gavage, najlepiej natychmiast ją usunąć i przesunąć na miejsce.
10. Wróć zwierzę do klatki i obserwuj pod kątem kaszlu lub oznak niedogodności oddechowej, ponieważ może to wskazywać na niezamierzone podanie tchawicy lub aspirację podgrzanego inokulum zarodnika.
    UWAGA: Myszy są niezwykle podatne na C. difficile po leczeniu antybiotykowym; Dlatego konieczne są środki zapobiegające krzyżowemu zanieczyszczeniu między klatkami. Jest to szczególnie ważne przy zarządzaniu myszami leczonymi antybiotykami, ale nieprzezwanymi jako kontrolą.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
#62 Środek dezynfekujący Perisept Sporidicial	SSS Navigator	48027	Ten produkt będzie wymagał rozcieńczenia zgodnie z zaleceniami producenta
Myszy C57BL/6J	Laboratorium Jacksona	664	Myszy powinny mieć 5-8 tygodni życia
2 ml nakrętka mikrowirówki	Corning	430917