Artykuł metodologiczny

Łączenie barwnika lipofilowego, hybrydyzacji in situ, immunohistochemii i histologii

27.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/2451

⸱

17 marca 2011

 ,  ,  , 
1Department of Biology, University of Iowa, 2Molecular Targeting Technologies, Inc.

W tym artykule

Podsumowanie

Przedstawiono kombinację różnych technik w celu maksymalizacji zakresu gromadzonych danych z tkanki mysiej.

Streszczenie

Wyjście poza analizę funkcji pojedynczego genu w celu głębszego zbadania sieci regulacji genów wymaga połączenia wielu mutacji w jednym zwierzęciu. Taka analiza dwóch lub więcej genów musi być uzupełniona hybrydyzacją in situ innych genów lub immunohistochemią ich białek, zarówno w całych preparatach rozwijających się organów, jak i w ich przekrojach, aby uzyskać szczegółową rozdzielczość zmian w ekspresji komórkowej i tkankowej. Łączenie wielu zmian genetycznych wymaga zastosowania kreazy lub flipazy do kondycjonalnego usuwania genów w celu uniknięcia letalności zarodkowej. Wymagane schematy krzyżowania drastycznie zwiększają nakład pracy i koszty proporcjonalnie do liczby zmutowanych genów, co skutkuje uzyskaniem bardzo niewielu zwierząt z pełnym zestawem pożądanych modyfikacji genetycznych. Amortyzacja ogromnego nakładu pracy i czasu potrzebnego na pozyskanie tych kilku cennych osobników z wieloma mutacjami wymaga optymalizacji wykorzystania tkanek. Co więcej, badanie jednego zwierzęcia za pomocą wielu technik ułatwia korelację defektów wynikających z delecji genów z profilami ekspresji. Opracowaliśmy technikę pozwalającą na przeprowadzenie bardziej szczegółowej analizy danego zwierzęcia, umożliwiającą badanie kilku różnych, rozpoznawalnych histologicznie struktur, a także ekspresję genów i białek z jednego okazu, zarówno w całych organach, jak i w ich przekrojach. Chociaż do wykazania skuteczności tej techniki wykorzystano myszy, można ją zastosować w szerokim zakresie gatunków zwierząt. W tym celu łączymy śledzenie za pomocą barwników lipofilnych, hybrydyzację in situ w całych preparatach, immunohistochemię oraz histologię, aby wydobyć maksymalną możliwą ilość danych.

Protokół

1. Wstrzykiwanie barwnika lipofilowego

Przygotowanie tkanki:

Wszystkie preparacje i manipulacje tkankowe są przeprowadzane na zwierzętach utrwalonych w 4% paraformaldehydzie (PFA) w 0,1 M buforze fosforanowym (pH 7,4) poprzez perfuzję transkardialną z użyciem pomp perystaltycznych z igłami o odpowiedniej średnicy. Tkankę można przechowywać w 4% PFA w lodówce do 6 miesięcy. Wszystkie etapy przygotowania i manipulacji są wykonywane w PFA o stężeniu 0,4% lub wyższym, aż do momentu montowania w glicerolu do obrazowania. Takie stężenie PFA skutecznie eliminuje RNazy i chroni RNA do hybrydyzacji in situ.

Przechowywanie barwnika:

Wszystkie barwniki należy przechowywać w ciemnej, zamkniętej komorze, aby zminimalizować cyrkulację powietrza i ekspozycję na jasne światło dzienne, ponieważ są one światłoczułe. Aby uniknąć zanieczyszczeń krzyżowych, do obsługi każdego barwnika należy używać osobnego zestawu narzędzi.

  1. W pierwszej kolejności należy wybrać miejsce aplikacji barwnika i usunąć zbędne tkanki, aby wizualnie potwierdzić wybrane miejsce oraz umożliwić umieszczenie barwnika. Wybór miejsca aplikacji jest najważniejszym etapem tego procesu. Wybór odpowiedniego miejsca do znakowania rozważanej populacji neuronów, a nie struktur pobocznych, może być trudny. Precyzyjne umieszczenie barwnika w danym szlaku pod kontrolą wizualną w mikroskopie sekcyjnym wymaga pewnego poziomu znajomości odpowiedniej neuroanatomii. Barwnik można umieścić centralnie lub obwodowo, aby odpowiednio znakować projekcje obwodowe lub centralne, zgodnie z potrzebami danego projektu (np. mózg, nerw obwodowy, ucho, oko). Barwniki lipofilne dyfundują we wszystkie wypustki danego neuronu, zarówno retrogradnie, jak i anterogradnie, wypełniając dany neuron lub wszystkie neurony projektujące do danego szlaku.
  2. Barwnik NeuroVue od MTTI jest dostarczany wstępnie naniesiony na paski filtrujące dla łatwiejszej aplikacji. Barwnik można również rozpuścić w 100% DMSO (pracować pod wyciągiem), a następnie namoczyć w tym roztworze cienki włos i wysuszyć go do mniejszych aplikacji. Wstępnie nasączony papier filtrujący z barwnikiem jest wycinany mikronożyczkami na trójkątne kawałki o odpowiedniej wielkości. Rozmiar fragmentu barwnika zależy od wielkości preparatu, rozmiaru znakowanej struktury oraz liczby kolorów używanych jednocześnie. Należy wyciąć jak najmniejszy fragment, aby uniknąć znakowania innych struktur. Po użyciu mikronożyczek do cięcia i pęsety do manipulowania barwnikiem, należy opłukać instrumenty w alkoholu, aby usunąć pozostałości barwnika, a następnie całkowicie wysuszyć na powietrzu lub osuszyć papierem. Ma to na celu uniknięcie zanieczyszczenia preparatu pozostałościami barwnika na narzędziach, co mogłoby doprowadzić do znakowania niepożądanych struktur.
  3. W przypadku wprowadzania do tkanek miękkich, takich jak mózg, filtr można włożyć bezpośrednio, używając wierzchołka trójkąta filtra do przebicia tkanki. W przypadku tkanek sztywniejszych należy wykonać nacięcie, aby ułatwić wprowadzenie barwnika. Nie należy używać igły sekcyjnej do wpychania filtra w tkankę. Może to spowodować nieprecyzyjne umieszczenie i uszkodzenie tkanki. W razie potrzeby znakowania dodatkowych populacji neuronów, należy wprowadzić barwnik NeuroVue o innych długościach fal.
  4. Po wprowadzeniu barwnika i zweryfikowaniu jego pozycji, preparaty umieszcza się w szczelnie zamkniętej fiolce z 4% PFA i inkubuje w temperaturze 36°C w ciemności przez 2-14 dni, w zależności od wieku i dystansu dyfuzji do pokonania (około 2 mm na dobę w 36°C).
  5. Do oceny, czy barwnik dyfundował do pożądanego miejsca, można użyć mikroskopu sekcyjnego z epifluorescencją; jeśli dyfuzja zostanie uznana za niewystarczającą, preparat można ponownie umieścić w inkubatorze. Użycie zwykłego mikroskopu sekcyjnego bez epifluorescencji do wykrywania dyfuzji spowoduje niedoszacowanie rzeczywistej długości, na jaką dyfundował barwnik. Ponadto, jeśli stężenie barwnika jest wystarczająco wysokie, aby ocenić je wizualnie, może to spowodować gaszenie absorpcyjne podczas korzystania z fluorescencji emisyjnej.
  6. Pożądana tkanka jest wycinana i montowana w całości na szkiełku w glicerolu, a następnie przykrywana szkiełkiem podstawowym w celu obrazowania za pomocą mikroskopu konfokalnego. Ustawienia konfokalne są opisane w 1, 2. Jeśli rozmiar tkanki uniemożliwia montowanie w całości na szkiełku, konieczne jest cięcie seryjne (patrz poniżej). Więcej szczegółów na temat przygotowania tkanki do obrazowania i właściwości spektralnych barwników dostępnych jest pod adresem: http://www.mtarget.com/mtti/documents/NeuroVuebrochuremar2010.pdf

Rozwój embrionalnego mózgu, mikroskopia fluorescencyjna, znakowanie nerwów, TN GN VN, szlaki neuronalne.
Rysunek 1. Schematyczny przegląd eksperymentu. Ucho zostaje odsłonięte, aby umożliwić wizualizację wszystkich struktur. Następnie wstrzykuje się barwnik lipofilowy i pozostawia go do dyfuzji. Po dyfuzji można zaobserwować odrębne populacje neuronów znakowane różnymi barwnikami. Następnie w uchu przeprowadza się hybrydyzację in situ (Sox2), która znakuje ekspresję mRNA. Następnie wykonuje się immunohistochemię (Myo7, Tubulin) w celu wizualizacji ekspresji białek. Całość kończy wykonanie przekrojów histologicznych, na których można zwizualizować zarówno hybrydyzację in situ, jak i immunohistochemię.

2. Hybrydyzacja in situ

W przypadku chęci rozpoczęcia od hybrydyzacji in situ (po której śledzenie przy użyciu barwników lipofilowych będzie niemożliwe), należy odnieść się do przygotowania tkanki w Części 1. Każde przemywanie, o ile nie wskazano inaczej, wykonuje się przy użyciu 2 mL roztworu w temperaturze pokojowej na mieszalniku z funkcją odwracania. Należy upewnić się, że praca odbywa się w czystym środowisku wolnym od RNaz.

  1. Odwodnij, a następnie rehydratuj próbki, stosując gradient stężeń metanolu.
    1. 100% przez 1 godzinę do nocy w 4°C (opcjonalnie: przechowuj próbki w -20°C w 100% metanolu)
    2. 75% przez 5 min. w 4°C
    3. 50% przez 5 min. w 4°C
    4. 25% przez 15 min. w 4°C (lub do momentu opadnięcia tkanki na dno)
    5. Przenieś próbki do probówki typu eppendorf o pojemności 2 mL (wolnej od RNaz).
  2. Przemyj trzy razy w PBS (1x PBS) i włącz inkubator do hybrydyzacji w celu przygotowania go do późniejszego użycia (60°C).
    1. PBS przez 5 min.
    2. PBS przez 5 min.
    3. PBS przez 5 min.
  3. Przeprowadź trawienie tkanki za pomocą 2 μL roztoku Proteinazy K o stężeniu 20mg/ mL (Ambion Kat. nr AM2546) w 2,0 mL świeżego PBS.
    Rzeczywisty czas trawienia PK zależy od wieku embrionu. Poniżej przedstawiono szacunkowe czasy. Trawienie należy ściśle monitorować, ponieważ deproteinizacja jest krytycznym etapem. Niedostateczne trawienie spowoduje słabą penetrację sondy, natomiast nadmierne trawienie doprowadzi do utraty integralności strukturalnej. Dobrym wskaźnikiem trawienia jest zmiana wyglądu tkanki z mętnej na niemal przezroczystą.
    Tabela 1. Czas trawienia Proteinazą K w tkance mysiej.
    WIEK (dzień embrionalny)CZAS (minuty)
    E8.5 6
    E9.5 10
    E10.5 13
    E11.5 15
    E12.5 17
    E14.5 18
    E16.5+ 20+
  4. Zatrzymaj trawienie, inkubując próbki w 4% PFA przez 5 min.
  5. Przemyj w PBS.
    1. PBS przez 1 min.
    2. PBS przez 5 min.
    3. PBS przez 5 min.
    4. PBS przez 5 min.
  6. Odlaj PBS, dbając o usunięcie go w jak największym stopniu.
  7. Przeprowadź prehybrydyzację próbek: inkubuj w 60°C na mieszadle obrotowym w 1,8 mL mieszaniny do hybrydyzacji przez co najmniej 1 godzinę. Ustaw blok grzejny IsoTemp na 85°C do późniejszego użycia.
    1. Pod koniec godziny zdenaturuj DNA sperm łososia (Invitrogen Kat. nr 15632-011) poprzez inkubację w 85°C przez 10 min. Przechowuj na lodzie do momentu użycia.
  8. Po co najmniej 1 godzinie prehybrydyzacji dodaj do każdej próbki 200 μL zdenaturowanego ssDNA oraz około 100ng ribosondy znakowanej DIG. Przeprowadź hybrydyzację przez noc w 60°C w inkubatorze do hybrydyzacji.
  9. Zastąp mieszaninę do hybrydyzacji 2 mL 2X SSC. Ustaw bloki grzejne IsoTemp na 37°C i 70°C do późniejszego użycia.
    1. Przemyj 2X SSC przez 10 min. w 60°C w inkubatorze do hybrydyzacji.
    2. Przemyj 2X SSC przez 10 min. w 60°C w inkubatorze do hybrydyzacji.
    3. Przemyj 2X SSC przez 10 min. w 60°C w inkubatorze do hybrydyzacji.
    4. Przemyj 2X SSC przez 60 min. w 70°C w bloku grzejnym IsoTemp.
    Temperatura 70°C usuwa endogenną aktywność fosfatazy alkalicznej. Jest to prawdopodobnie najważniejszy etap redukcji tła. Krok (d) można podzielić na dwa przemycia po 30 min., aby zminimalizować uszkodzenia tkanki.
  10. Przemyj w PBS przez 5 min. Odmroź enzym RNaza A na lodzie do późniejszego użycia.
  11. Wymień PBS i dodaj 1,0 μL enzymu RNaza A (Fermentas EN0531 10mg/ mL) na 60 min. w 37°C w bloku grzejnym IsoTemp (preferowany jest 90-minutowy okres inkubacji, jeśli sonda jest silnie skoncentrowana).
  12. Odlaj PBS/RNazę A i przemyj 4 razy.
    1. 1X roztwór do mycia przez 10 min.
    2. 1X roztwór do mycia przez 10 min.
    3. 1X roztwór do mycia przez 10 min.
    4. 1X roztwór do mycia przez 60 min. w 70°C w bloku grzejnym IsoTemp.
  13. Inkubuj w 1X buforze blokującym przez 1 godzinę.
    1. W tym czasie przygotuj 2,0 mL buforu blokującego i 1 μL (1:2000) przeciwciała anty-digoksigeninowego na próbkę. Krótko wymieszaj przez odwracanie i pozostaw w 4°C do momentu użycia.
  14. Po 1 godzinie odlej bufor blokujący i dodaj do próbek 2,0 mL preabsorbowanego buforu blokującego z przeciwciałem.
  15. Inkubuj przez noc.
  16. Odlaj roztwór blokujący.
  17. Przemyj 1X buforem do mycia.
    1. 1X bufor do mycia przez 5 min.
    2. 1X bufor do mycia przez 5 min.
    3. 1X bufor do mycia przez 1 godzinę z 5-6 wymianami.
  18. Przemyj 1X buforem do mycia przez noc.
  19. Przepłucz 1X buforem detekcyjnym przez 10 min.
  20. Przenieś próbki w buforze detekcyjnym na płytkę wielodołkową.
  21. Usuń bufor i przeprowadź detekcję za pomocą BM Purple (Roche 11442074001) aż do uzyskania pożądanej siły sygnału (w przypadku dłuższych sond może to potrwać całą noc). BM Purple jest światłoczuły, należy go osłonić folią lub pudełkiem.
    • Dokładnie wymieszaj BM Purple przed użyciem.
    • Upewnij się, że próbki swobodnie pływają i nie przywierają do dołków.
    • Sprawdź sygnał po 1 godzinie.
  22. Przepłucz próbki w dołkach 1X buforem detekcyjnym przez 5 min.
  23. Wykonaj obrazowanie lub przechowuj próbki w 4% PFA w 4°C.

*Próbki można obrazować na tym etapie i/lub po dodaniu etapu immunohistochemii (Część 3 poniżej).

Roztwory:

  • Woda wolna od nukleaz: Wymieszać 1 mL DEPC (Sigma) z 1L sterylnej wody ultrapure. Autoklawować.
  • 1X PBS: Rozpuścić 1 opakowanie PBS (Sigma) w 1L wody wolnej od nukleaz i wysterylizować przez filtrację.
  • 1X roztwór do płukania: Wymieszać 450 mL wody wolnej od nukleaz + 50 mL 10x roztworu do płukania i wysterylizować przez filtrację.
  • Mieszanina do hybrydyzacji: 50% formamidu objętościowo (25 mL); 50% 2X SSC objętościowo (25 mL); 6% siarczanu dekstranu masowo (3g).
  • 1X bufor detekcyjny: Wymieszać 50 mL 10X buforu detekcyjnego z 450 mL wody wolnej od nukleaz i wysterylizować przez filtrację.
  • 1X bufor blokujący: 5 mL 10X buforu kwasu maleinowego (Roche buffer set); 40 mL wody wolnej od nukleaz; 5 mL 10X buforu blokującego.
  • 2X SSC: Wymieszać 50 mL 20X SSC z 450 mL wody wolnej od nukleaz i wysterylizować przez filtrację.
  • Metanol w gradientach stężeń: Rozcieńczyć 100% metanol wodą wolną od nukleaz do stężeń 75%, 50% i 25%.

3. Immunohistochemia

Kroki 1 i 2 można pominąć, jeśli zrealizowano Część 2. W takim przypadku należy upewnić się, że cały glicerol lub inny środek montażowy został wypłukany. Należy pamiętać, że nie wszystkie przeciwciała będą w stanie wykryć swój epitop po trawieniu proteinazą K. Dysponujemy krótką listą przeciwciał, które mogą być stosowane w połączeniu z hybrydyzacją in situ w tkankach ssaków, ponieważ zachowują one swoją swoistość (patrz Tabela 2).

  1. Szereg rozcieńczeń etanolu w celu usunięcia z tkanki barwników lipofilowych (jeśli nie zostało to osiągnięte w Części 2): 50% etanol 5 min., 70% etanol 5 min., 95-100% etanol przez noc lub do uzyskania pożądanego efektu, 70% etanol 5 min., 50% etanol 5 min.
  2. Rehydratacja poprzez stopniowe dodawanie PBS w ciągu 5-10 minut.
  3. Blokowanie tkanki przez 1 h w 2,5% normalnym surowicy koziej (NGS) i 0,5% Triton X-100 w RT na shakerze.
    (1:1 5% NGS:1,0% TritonX-100 w 1x PBS)
  4. Inkubacja z przeciwciałami pierwszorzędowymi rozcieńczonymi w roztworze blokującym przez 48-72 h w 4°C na shakerze.
  5. Przemywanie PBS przez 1 h x 3 zmiany.
  6. Blokowanie zgodnie z krokiem 3.
  7. Inkubacja z przeciwciałami wtórnymi rozcieńczonymi w roztworze blokującym przez 12-24 h w 4°C na shakerze (użyto barwników Alexa Fluor® od Invitrogen).
  8. Przemywanie zgodnie z krokiem 5. (Opcjonalnie: przeciwbarwienie jądrami barwnikiem Hoechst; podczas pierwszego przemywania rozcieńczyć roztwór stokowy 10 mg/mL w stosunku 1:2000 w PBS. Następnie przeprowadzić przemywania w PBS przez 1 h x 2-3 zmiany w RT na shakerze)
  9. Obrazowanie: Na tym etapie próbki można obrazować za pomocą mikroskopii transmisyjnej i epifluorescencyjnej, najlepiej wykorzystując system obrazowania konfokalnego w celu uzyskania wyższej rozdzielczości. W tym celu rutynowo montujemy całe uszy w glicerolu, używając szkiełek podstawowych jako dystansów, aby uniknąć nadmiernej kompresji tkanki. Dodatkowo lub zamiast obrazowania całych preparatów, próbki można zatopić w żywicy epoksydowej i poddać seryjnemu cięciu w celu uzyskania dodatkowych szczegółów histologicznych. Aby w pełni wykorzystać połączoną analizę całych preparatów i przekrojów, należy unikać fotowybielania sygnału fluorescencyjnego podczas obrazowania konfokalnego.

Roztwory

  • Roztwory etanolu: Rozcieńczyć 100% etanol w wodzie destylowanej do stężeń końcowych 50% i 70%.
  • Roztwór blokujący: Rozcieńczenie 1:1 5% NGS:1,0% TritonX-100 w 1x PBS (końcowe stężenia robocze: 2,5% NGS; 0,5% TritonX-100).
  • 1X PBS: Rozpuścić 1 opakowanie PBS (Sigma) w 1L wody destylowanej.
  • 5% NGS: Odmrozić 2,5 mL NGS i wymieszać z 47,5 mL 1x PBS. Przechowywać w temperaturze 4°C.
  • 1,0% TritonX-100: Wymieszać 49,5 mL 1x PBS z 0,5 mL TritonX-100 (mieszać na wytrząsarce w RT przez 1 godzinę). Przechowywać w temperaturze 4°C.
  • Roztwór stokowy barwnika Hoechst: Rozpuścić 10mg barwnika Hoechst na mililitr 1x PBS.
Tabela 2. Przeciwciała działające w tkankach trawionych proteinazą K.
Nr kat.ProduktDostawca
25-6790Anti-Myosin-VIIA PolyclonalProteus Biosciences
25-6791Anti-Myosin-VI PolyclonalProteus Biosciences
9661Cleaved Caspase-3 Polyclonal Cell Signaling
T7451Anti-Acetylated Tubulin MonoclonalSigma
PRB-238CProx1 polyclonal Covance

4. Histologia

Histologię można wprowadzić po Części 1, aby zwiększyć rozdzielczość śledzenia barwnikiem lipofilowym w grubych preparatach całych organów, takich jak mózgi osobników młodocianych, lub po zakończeniu Części 2 lub 3. W przypadku seryjnych przekrojów mózgu zalecamy użycie mikrotomu Compresstome VF-700 (Precisionary Instruments Inc., Greenville, North Carolina), aby uzyskać jednolitą grubość skrawków. Przekroje mrożone są mniej optymalne ze względu na większy wyciek barwnika podczas procesu krojenia 3. Przygotowanie seryjnych przekrojów i ich montaż w glicerolu 4 jest preferowaną metodą przygotowania tkanki, gdy preparaty całych organów lub preparaty powierzchniowe nie pozwalają na odpowiednią wizualizację interesujących obszarów tkanki. Tkankę można również następnie zatopić w żywicy epoksydowej i ciąć na grubość 1-2 μm przy użyciu noży szklanych lub diamentowych do TEM. Przy zastosowaniu tej techniki większość immunofluorescencji zostaje zachowana i jest nawet bardziej stabilna po zatopieniu w plastiku, jednak wszelkie ślady barwników lipofilowych zostaną na tym etapie całkowicie utracone, ponieważ rozpuszczają się one w alkoholu i żywicy epoksydowej. Należy zachować ostrożność, ponieważ próbki są światłoczułe do momentu ich zatopienia.

W przypadku krojenia sekcji przy użyciu mikrotomu Compresstome VF-700 należy postępować zgodnie z zaleceniami firmy Precisionary Instruments Inc.

Zatopienie w żywicy epoksydowej i krojenie:

  1. Fiksacja: 2,5% gluteraldehyd/1% PFA w 0,1M buforze fosforanowym (pH 7,4) przez 1 godzinę do nocy.
  2. Odwodnienie tkanki w szklanej fiolce z próbką: 30% etanol (5 min.), 50% etanol (5 min.), 70% etanol (od 5 min. do nocy), 95% etanol (5x 10 min. każdy) oraz etanol bezwodny (5x 10 min. każdy).
  3. Rozpuszczalnik przejściowy: 1:1 etanol bezwodny:tlenek propylenu (PO) przez 5 min.
  4. Rozpuszczalnik: sam PO 5x 10 min. każdy.
  5. Infiltracja żywicą:
    1. 1:1 PO:żywica przez noc na wytrząsarce.
    2. Przelanie roztworu z próbką(ami) do płaskiej formy do zatapiania i pozostawienie na blacie na 4-6 godzin w celu odparowania PO. Alternatywnie można zdjąć zakrętkę fiolki i pozostawić na wytrząsarce przez 4 godziny (metoda ta sprawdza się przy większych tkankach).
    3. Przeniesienie próbek do 100% żywicy na 4 godziny.
  6. Zatapianie w żywicy w końcowej formie z etykietą. Polimeryzacja poprzez inkubację w 60°C przez 24-48 godzin.
  7. Przycięcie bloku żywicy ostrzem do żyletki w celu zminimalizowania nadmiaru żywicy. Wykonanie seryjnych skrawków o grubości 1-2 µm na ultramikrotomie (użyto Ultracut E Reichert-Jung). Montaż i obrazowanie z wykorzystaniem mikroskopii epifluorescencyjnej.
    Opcjonalnie: Jeśli jest to pożądane, można zabarwić część skrawków barwnikami histologicznymi (np. błękitem Stevenela) (należy pamiętać, że w takich skrawkach immunofluorescencja nie zostanie zachowana).

Roztwory

  • Roztwory etanolu: rozcieńczyć 100% etanol w wodzie destylowanej do stężeń 30%, 50%, 70% i 95%.
  • Roztwór do fiksacji: zmieszać 2,5 mL 50% glutaraldehydu, 5 mL 10% paraformaldehydu oraz 42,5 mL 0,1M buforu fosforanowego pH 7,4 (stężenia końcowe: 2,5% glutaraldehydu; 4% PFA). Przechowywać w temperaturze 4°C.
  • Żywica epoksydowa: przygotować zgodnie z instrukcją dołączoną do zestawu Poly/Bed 812 Embedding Media/DMP-30 Kit (Polysciences, Inc. #08792-1). Przechowywać w temperaturze -20°C.

5. Reprezentatywne wyniki

Analiza struktury ślimaka; fluorescencja i barwienie; schemat biologiczny; narząd Cortiego (OC), zwoj ganglionowy spirali (SG).
Rysunek 2. Aplikacja barwnika lipofilowego i obrazowanie w embrionie myszy. Wstrzyknięto i inkubowano trzy różne barwniki lipofilowe o różnych długościach fal, aby umożliwić wizualizację projekcji centralnych nerwu trójdzielnego (TN), nerwu językowo-gardłowego (GN) i nerwu błędnego (VN). A) Aplikacja barwnika lipofilowego do części obwodowych trzech nerwów czaszkowych, aby umożliwić dyfuzję do pnia mózgu w celu wizualizacji ich procesów centralnych. TN został oznakowany barwnikiem NeuroVue Red, GN: NeurVue Maroon, a VN: NeuroVue Jade. B) Ta sama mysz co w (A) po inkubacji. W mikroskopii w świetle przechodzącym widoczna jest częściowa dyfuzja. C) Ta sama mysz co w (A i B). Tylony mózg został wypreparowany i zamontowany płasko. W mikroskopii w świetle przechodzącym widoczne jest częściowe oznakowanie procesów centralnych trzech oznakowanych nerwów. D) Obraz konfokalny z (C). Dzięki zastosowaniu mikroskopu konfokalnego można dostrzec konkretne neurony, a użycie trzech różnych barwników pozwala na ocenę rozkładu każdej populacji w stosunku do pozostałych. Barwniki obrazowano sekwencyjnie. NeuroVue Jade obrazowano przy pobudzeniu 488 nm i emisji 500-550 nm. NeuroVue Red obrazowano przy pobudzeniu 535 nm i emisji 550-600 nm. NeuroVue Maroon obrazowano przy pobudzeniu 643 nm i emisji 650-700 nm.

Procesy rozwoju zarodkowego: dyfuzja barwnika, immunohistochemia, schemat hybrydyzacji in situ.
Rysunek 3. Schematyczny przegląd eksperymentu. Ucho zostaje odsłonięte, aby umożliwić wizualizację wszystkich struktur. Następnie wstrzykiwany jest barwnik lipofilowy i pozostawia się go do dyfuzji. Po dyfuzji można zaobserwować odrębne populacje neuronalne oznakowane różnymi barwnikami. W kolejnym kroku w uchu przeprowadza się hybrydyzację in situ (sox2), która znakuje ekspresję mRNA. Następnie wykonuje się immunohistochemię (Myo7, Tubulin) w celu wizualizacji ekspresji białek. Całość kończy wykonanie przekrojów histologicznych, na których można zwizualizować zarówno hybrydyzację in situ, jak i immunohistochemię.

Dyskusja

W niniejszym filmie prezentujemy metodę łączącą cztery techniki w celu maksymalizacji zakresu zbieranych danych oraz ich spójności poprzez korelację danych w obrębie danego zwierzęcia (rycina 3). Podejście to pozwoli ograniczyć liczbę zwierząt hodowlanych, a tym samym skrócić czas potrzebny na uzyskanie danych nadających się do publikacji, przy jednoczesnym zwiększeniu ilości informacji na temat kolokalizacji i efektów korelacyjnych mutantów. Choć w filmie wykorzystano embriony myszy, za pomocą tych technik można analizować również dorosłe myszy, jak i inne zwierzęta, takie jak kurczaki, Xenopus oraz zebrafish. W przypadku stosowania innych gatunków może być konieczna modyfikacja trawienia proteinazą K. W tym protokole używamy różnych fluorescencyjnych barwników NeuroVue do specyficznego znakowania do trzech wybranych populacji neuronów. Zaletą tych barwników jest możliwość ich stosowania u myszy mutantów, co może być problematyczne w przypadku polegania wyłącznie na immunohistochemii, która może lub nie może być wpływana przez analizowane mutacje; dodatkowo barwniki te znakują neurony w sposób retrogradny i anterogradny. 5Niedawne badanie pozwoliło również zwiększyć liczbę populacji neuronów, które można znakować jednocześnie, do sześciu. 2Następnie barwnik lipofilowy, znakujący tę samą badaną tkankę, może zostać poddany analizie przy użyciu in situ hybrydyzacja, służąca do analizy transkrypcji genów, która może być następnie analizowana za pomocą immunohistochemii w celu określenia rozkładu białek. Tę drugą analizę można uzupełnić szczegółową histologią, która może przyczynić się do charakterystyki fenotypu 6Ta wieloczynnikowa analiza stwarza możliwość uzyskania nowych spostrzeżeń dzięki analizie korelacyjnej przeprowadzanej w obrębie tego samego zwierzęcia, co w przeciwnym razie mogłoby być mało prawdopodobne lub wymagało zastosowania bardziej rozbudowanych protokołów oraz hodowli myszy.

Oświadczenia

Tkanki mysie pobrano zgodnie z wytycznymi i regulacjami określonymi przez Komitet ds. Opieki i Korzystania ze Zwierząt Instytucjonalnych Uniwersytetu Iowa (ACURF 0804066).

Podziękowania

Obrazy konfokalne uzyskano w University of Iowa Carver Center for Imaging. Finansowanie zostało zapewnione przez grant SBIR (MH079805) dla B.F. Dodatkowe wsparcie w zakresie hodowli myszy na potrzeby tego projektu zostało zapewnione przez NIDCD (5R01DC00559007) dla B.F.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
in situ Hybrydyzacja:
zestaw buforów do płukania i blokowania PC DIGGrupa Roche1585762
Bufor 20x SSC (premix)Grupa Roche1666681
Proteinaza K 20 mg/mlAmbionAM2546
piroseczczan dwuetylowy (DEPC) Research Products International Corp.D43060
FormamidSigma-AldrichF9037
Siarczan dekstranuResearch Products International Corp.D20020
BM Purple Grupa Roche11442074001
Fragmenty Fab anty-Dig-APGrupa Roche11093274910
enzym RNaza A 10 mg/mlFermentasEN0531
RNase AwayResearch Products International Corp.7003
DNA nasienia łososia 10 mg/mlInvitrogen15632-011
Jednostka filtrująca Stericup 0,22 µmμm; 500 mlEMD MilliporeSCGVU05RE
dyski filtrujące 0,2 μmμm; 25 mmWhatman, GE Healthcare6780-2502
saszetki z fosforanem buforem solnym pH 7,4Sigma-AldrichP-5368
Immunohistochemia:
Surowica koziaSigma-AldrichG9023
Triton X-100Sigma-AldrichT8532
H–barwnik Crystal VioletPolysciences, Inc.9460
Histologia:
Zestaw Poly/Bed 812 Embedding Media/DMP-30 Polysciences, Inc.08792-1
Tlenek propylenuSigma-Aldrich110205
Roztwór glutaraldehydu 50%Fisher ScientificG151
Medium montażowe DPXFluka44581
KołysarkaMidSci55D1114
Blok grzewczyFisher Scientific11-715-125D
RotatorThermo Fisher Scientific, Inc.400110Q
Inkubator ustawiony na 60°C°Fisher Scientific11-690-625D
Śledzenie barwnikiem:
MikronożyceGeuderG-19775
Precyzyjna pęsetaE.M.S72680-F
Barwniki NeuroVue: bordowy, czerwony, jadeitowyMTTIFS-100(1,2,6)
1X roztwór soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS)Sigma-AldrichP-5368
Zakres sekcjiLeica MicrosystemsM205 FA
Inkubator ustawiony na 36°Fisher Scientific11-690-506DQ
Mikroskop konfokalnyLeica MicrosystemsLSM 510
SlajdySurgipath00240
Szkiełka nakrywkoweSurgipath00106
RPIGlicerolG22025-0.5
Paraformaldehyd (4% i 0,4%)Fisher ScientificT353-500

Bibliografia

  1. Jensen-Smith, H., Gray, B., Muirhead, K., Ohlsson-Wilhelm, B., Fritzsch, B. Long-distance three-color neuronal tracing in fixed tissue using NeuroVue dyes. Immunol Invest. 36, 763-789 (2007).
  2. Tonniges, J. Photo- and bio-physical characterization of novel violet and near-infrared lipophilic fluorophores for neuronal tracing. Journal of Microscopy. , (2010).
  3. Bartheld, C. S. von, Cunningham, D. E., Rubel, E. W. Neuronal tracing with DiI: decalcification, cryosectioning, and photoconversion for light and electron microscopic analysis. J Histochem Cytochem. 38, 725-733 (1990).
  4. Gurung, B., Fritzsch, B. Time course of embryonic midbrain thalamic and thalamic auditory connection development in mice as revealed by carbocyannine dye injection. J Comp Neurol. 479, 309-327 (2004).
  5. Fritzsch, B., Nichols, D. H. DiI reveals a prenatal arrival of efferents at the differentiating otocyst of mice. Hear Res. 65, 51-60 (1993).
  6. Jahan, I., Kersigo, J., Pan, N., Fritzsch, B. Neurod1 suppresses hair cell differentiation in ear ganglia and regulates hair cell subtype development in the cochlea. PloS ONE. 5, e11661-e11661 (2010).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

ledzenie za pomoc barwnika lipofilowegoanaliza ca ych preparat wsekcjonowanie tkanekmikroskopia konfokalnamikroskopia transmisyjnaanaliza ekspresji gen wanaliza ekspresji bia ek
Łączenie barwnika lipofilowego, hybrydyzacji in situ, immunohistochemii i histologii
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.