Izolacja mitochondriów z mięśni szkieletowych

Podsumowanie

Niniejszy protokół opisuje procedurę badania oddychania mitochondriów izolowanych z mięśni szkieletowych. Metoda ta została opracowana na podstawie pracy Scorrano et al. (2007). Procedura izolacji mitochondriów zajmuje około 2 godzin. Pomiar oddychania mitochondriów może zostać ukończony w ciągu około 1 godziny.

Streszczenie

Mitochondria są organellami kontrolującymi życie i śmierć komórki. Uczestniczą w kluczowych reakcjach metabolicznych, syntetyzują większość ATP i regulują szereg kaskad sygnalizacyjnych^2,3. Badacze w przeszłości i obecnie izolowali mitochondria z tkanek szczura i myszy, takich jak wątroba, mózg i serce^4,5. W ostatnich latach wielu badaczy skoncentrowało się na badaniu funkcji mitochondriów w mięśniach szkieletowych.

W niniejszej pracy opisujemy metodę, którą z sukcesem stosowaliśmy do izolacji mitochondriów z mięśni szkieletowych ⁶. Nasza procedura wymaga, aby wszystkie bufory i odczynniki były świeżo przygotowane, a do analizy niezbędne jest około 250-500 mg mięśnia szkieletowego. Badaliśmy mitochondria izolowane z mięśnia brzuchatego łydki i przepony szczura i myszy oraz z mięśni pozagałkowych szczura. Stężenie białek mitochondrialnych mierzy się za pomocą analizy Bradforda. Istotne jest, aby próbki mitochondrialne były utrzymywane w niskiej temperaturze (na lodzie) podczas przygotowania, a badania funkcjonalne przeprowadzono w stosunkowo krótkim czasie (~1 h). Oddychanie mitochondrialne mierzy się za pomocą polarografii z elektrodą typu Clarka (system Oxygraph) w 37°C⁷. Kalibracja elektrody tlenowej jest kluczowym etapem tego protokołu i musi być wykonywana codziennie. Izolowane mitochondria (150 μg) dodaje się do 0,5 ml buforu eksperymentalnego (EB). Oddychanie w stanie 2 rozpoczyna się po dodaniu glutaminianu (5mM) i jabłczanu (2,5 mM). Następnie dodaje się adenozynodifosforan (ADP) (150 μM), aby zainicjować stan 3. Do oszacowania stanu 4 stosuje się oligomycynę (1 μM), która jest blokerem syntazy ATP. Na koniec dodaje się cyjano-karbid fenylhydrazonu z grupą p-trifluorometoksylową (FCCP, 0,2 μM), aby zmierzyć stan 5, czyli oddychanie rozsprzęgane ⁶. Po każdym doświadczeniu oblicza się wskaźnik kontroli oddechowej (RCR), będący stosunkiem stanu 3 do stanu 4. Wartość RCR ≥4 uznaje się za dowód uzyskania żywotnego preparatu mitochondriów.

Podsumowując, prezentujemy metodę izolacji żywych mitochondriów z mięśni szkieletowych, która może być wykorzystana w badaniach biochemicznych (np. aktywność enzymatyczna, detekcja immunologiczna, proteomika) oraz funkcjonalnych (respiracja mitochondrialna).

Protokół

1. Przygotowanie buforów

1. Włącz wirówkę 5804R i ustaw temperaturę na 4°C. Włącz łaźnię wodną Isotemp 3006D i ustaw temperaturę na 37°C.
2. Przed izolacją mięśni przygotuj następujące roztwory:
   • PBS: Rozpuść tabletki soli fosforanowo-buforowanej (PBS) w wodzie destylowanej (5 tabletek/litr). Wymieszaj dokładnie.
   • PBS z 10 mM EDTA: Aby przygotować 100 ml roztworu, dodaj 2 ml 500 mM EDTA do 98 ml PBS.
   • Bufor mitochondrialny 8X: 10,28 g sacharozy dla stężenia końcowego 0,6 M, 400 mg albuminy surowicy wołowej (BSA) wolnej od kwasów tłuszczowych dla stężenia końcowego 0,8%, 2,08 g HEPES dla stężenia końcowego 160 mM, dostosuj pH do 7,4 i uzupełnij wodą destylowaną do objętości 50 ml.
   • Bufor izolacyjny 1 (IB1): Dodaj 200 μl 500 mM EDTA dla stężenia końcowego 10 mM, 0,392 g D-mannitolu dla stężenia końcowego 215 mM, 1,25 ml buforu mitochondrialnego 8X, dostosuj pH do 7,4 i uzupełnij wodą destylowaną do objętości 10 ml.
   • Bufor izolacyjny 2 (IB2): Dodaj 60 μl 500 mM EGTA dla stężenia końcowego 3 mM, 0,392 g D-mannitolu dla stężenia końcowego 215 mM, 1,25 ml buforu mitochondrialnego 8X, dostosuj pH do 7,4 i uzupełnij wodą destylowaną do objętości 10 ml.
   • Bufor eksperymentalny (EB): Dodaj 100 μl 500 mM MgCl₂ dla stężenia końcowego 5 mM, 0,392 g D-mannitolu dla stężenia końcowego 215 mM, 25 μl 2,5 mM KH₂PO₄ dla stężenia końcowego 6,25 μM, 2 μl 100 mM EGTA dla stężenia końcowego 20 μM, 1,25 ml buforu mitochondrialnego, dostosuj pH do 7,4 i uzupełnij wodą destylowaną do objętości 10 ml.

2. Izolacja mięśnia

1. W wiaderku z lodem umieścić trzy zlewki o pojemności 10 ml, homogenizatory tkankowe Potter-Elvehjem oraz wszystkie pozostałe niezbędne narzędzia i materiały. Wszystkie elementy muszą pozostać schłodzone przez cały czas trwania eksperymentu.
2. Po zakończeniu prac umieścić IB1 i IB2 w wiaderku z lodem, a EB w ciepłej łaźni wodnej.
3. Do trzech zlewek o pojemności 10 ml należy dodać następujące roztwory:
   • Zlewka 1: 10 ml PBS
   • Zlewka 2: 10 ml PBS/EDTA
   • Zlewka 3: 3 ml IB1
4. Humanitarnie uśmiercić szczura zgodnie z zatwierdzeniem lokalnej Komisji ds. Etyki Doświadczeń na Zwierzętach (IACUC).
5. Szybko wyizolować 250-500 mg mięśnia szkieletowego, opłukać w zlewce 1, a następnie przenieść do zlewki 2.

3. Homogenizacja/izolacja mitochondriów

1. Przenieś mięsień do Zlewki 3 i drobno posiekaj go nożyczkami.
2. Przenieś roztwór do homogenizatora Potter-Elvehjem. Zhomogenizuj mięsień za pomocą zmotoryzowanego tłoka (można użyć wiertarki stołowej), powtarzając czynność 10 razy i przez cały czas utrzymując probówkę w lodzie.
3. Przenieś homogenat do schłodzonych wcześniej probówek do mikrocentryfugi o pojemności 2 ml i wiruj przy 700 g przez 10 minut w temperaturze 4° C.
4. Przenieś nadosad do nowej, schłodzonej wcześniej probówki do mikrocentryfugi. Osad odrzuć.
5. Wiruj nadosad przy 10 500 g przez 10 minut w temperaturze 4° C.
6. Przenieś nadosad do nowej, schłodzonej wcześniej probówki do mikrocentryfugi i oznacz ją jako SN1 (nadosad nr 1) oraz podaj typ mięśnia.
7. Resuspenduj osad w 500 μl buforu IB2.
8. Wiruj przy 10 500 g przez 10 minut w temperaturze 4° C.
9. Przenieś nadosad do nowej, schłodzonej wcześniej probówki do mikrocentryfugi i oznacz ją jako SN2 (nadosad nr 2) oraz podaj typ mięśnia.
10. Suspenduj końcowy osad mitochondrialny w 100 μl buforu IB2.
11. Ponownie wiruj końcową zawiesinę mitochondrialną w mikrocentryfudze przez kilka sekund. Jeśli utworzy się osad, przenieś nadosad do nowej, schłodzonej wcześniej probówki do mikrocentryfugi, a osad odrzuć.
12. Wyznacz stężenie białka za pomocą metody Bradforda ⁸.

4. Kalibracja elektrody

UWAGA: Przeprowadź pełną kalibrację elektrody podczas izolacji mitochondriów.

1. Do kolby o pojemności 250 ml dodać 100 ml wody destylowanej. Mieszać intensywnie przez 20 minut w celu wyrównania stężenia gazów atmosferycznych w wodzie.
2. Do elektrody oksygrafu dodać kilka kropli 50% KCl.
3. Na wierzchu elektrody umieścić mały kawałek niebieskiego papierka do skręcania Rizla.
4. Na papierku do skręcania umieścić kawałek membrany PTFE.
5. Za pomocą aplikatora do pierścieni założyć pierścień wewnętrzny, a następnie umieścić pierścień zewnętrzny w rowku elektrody.
6. Podłączyć elektrody i złożyć resztę aparatury: większą plastikową podstawę pierścieniową, komorę mitochondrialną oraz węże wodne.
7. Włączyć urządzenia Oxygraph i uruchomić oprogramowanie Oxygraph.
8. Wlać wyrównaną wodę do komory mitochondrialnej.
9. Włożyć mieszadło magnetyczne i ustawić prędkość obrotową na 60.
10. Rozpocząć nowy eksperyment.
11. Kliknąć opcję „calibrate”, a następnie „liquid phase calibration” dla Box 1. Zmienić temperaturę na 37° C i dwukrotnie kliknąć „OK”.
12. Gdy napis „Override” zmieni się na „OK”, kliknąć go i otworzyć butlę z azotem.
13. Wprowadzić końcówkę podłączoną do butli z azotem do komory, aby uzyskać zero tlenu. Kliknąć „OK”, gdy napis zmieni się z „Override”.
14. Odssać wodę i dodać 500 μl buforu EB do komór mitochondrialnych.
15. Zamknąć komorę za pomocą tłoka.
16. W przypadku użycia wielu urządzeń powtórzyć kroki 11–15 w celu kalibracji Box 2.

5. Oddychanie mitochondrialne

1. Rozpocznij nowy eksperyment; pozwól mu trwać przez około 1 minutę w celu stabilizacji sygnału.
2. Dodaj niezbędną objętość zawiesiny mitochondrialnej (krok 3.11), aby uzyskać 150 μg w każdej komorze, zaznacz zdarzenie i pozwól urządzeniu pracować przez 1 minutę.
3. Dodaj 10 μl podgrzanego roztworu glutaminianu/malonianu 250 mM/125 mM, aby uzyskać stężenie końcowe 5 mM/2.5 mM. Zaznacz zdarzenie i pozwól urządzeniu pracować przez 1 minutę. Jest to definiowane jako Stan 2.
4. Dodaj 7,5 μl 10 mM ADP, aby uzyskać stężenie końcowe 150 μM, zaznacz zdarzenie i pozwól urządzeniu pracować przez 30 sekund. Jest to definiowane jako Stan 3.
5. Dodaj kolejne 7,5 μl 10 mM ADP, zaznacz zdarzenie i pozwól urządzeniu pracować przez 1,5 minuty.
6. Dodaj 0,5 μl schłodzonej oligomycyny 10 mM, aby uzyskać stężenie końcowe 1 μM, zaznacz zdarzenie i pozwól urządzeniu pracować przez 3 minuty. Jest to definiowane jako Stan 4.
7. Dodaj 1 μl schłodzonego FCCP 0,1 mM, aby uzyskać stężenie końcowe 0,2 μM, zaznacz zdarzenie i pozwól urządzeniu pracować przez 3 minuty. Jest to definiowane jako Stan 5.
8. Po zakończeniu zakończ eksperyment i zapisz dane.
9. Pozyskaj wartości tempa oddychania za pomocą oprogramowania Oxygraph.
10. Wprowadź czynnik normalizacji: jeśli dodano 150 μg białka mitochondrialnego, czynnik normalizacji wyniesie 0,15.
11. Oblicz znormalizowane tempa oddychania dla poszczególnych stanów oddychania.
12. Oblicz wskaźnik kontroli oddychania (RCR), dzieląc wartość dla Stanu 3 przez wartość dla Stanu 4.

6. Reprezentatywne wyniki:

Rycina 1. przedstawia reprezentatywny zapis zużycia tlenu przez mitochondria mięśni szkieletowych. Po ustabilizowaniu sygnału z elektrody, próbkę mitochondriów dodaje się do komory Oxygraph. Respiracja stanu 2 rozpoczyna się po dodaniu glutaminianu i malonianu. Dodatek ADP zwiększa zużycie tlenu, co definiuje respirację stanu 3. Syntaza ATP zostaje zablokowana poprzez dodanie oligomycyny w celu uzyskania respiracji stanu 4. Na koniec dodaje się FCCP, aby odsprzęgać respirację mitochondrialną (stan 5). Tabela 1 przedstawia reprezentatywne tempo zużycia tlenu dla stanów 2, 3, 4 i 5. Dla każdego eksperymentu obliczany jest wskaźnik kontroli oddechowej (RCR). Wartość RCR ≥4 jest uznawana za dowód żywotności preparatu mitochondriów.

Stany	Znormalizowane szybkości
Stan 2	34.74
Stan 3	153.40
Stan 4	16.49
Stan 5	143.70
RCR	9.30

Tabela 1. Tempo respiracji mitochondrialnej.Reprezentatywne tempo zużycia tlenu w mitochondriach mięśni szkieletowych. Wartości zostały znormalizowane do ilości mitochondriów dodanych do komory. Współczynnik kontroli oddechowej (RCR) wyznaczono poprzez podzielenie stanu 3 przez stan 4. Wartość RCR≥4 oznacza żywotną preparację mitochondriów.

Dyskusja

Przedstawiamy protokół izolacji żywych mitochondriów z mięśni szkieletowych. W przypadku niskiej wydajności protokół można zmodyfikować, inkubując wyizolowany mięsień w 5 ml PBS/10mM EDTA/0,01% trypsyny przez 30 minut w lodzie. Aby zapewnić całkowite trawienie mięśnia trypsyną, mięsień musi zostać w pełni rozdrobniony. Po 30-minutowej inkubacji roztwór PBS/10mM EDTA/0,01% trypsyny należy całkowicie zastąpić 3 ml buforu izolacyjnego 1 (IB1). Ponadto zastosowanie trypsyny może wpływać na niektóre substraty mitochondrialne ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
95% CO22 / 5% O22 wymieszać	Lokalny dostawca gazu
Adenozyna 5′-difosforan, sól sodowa	Sigma-Aldrich	A2754
Niebieski papier Rizla	Hansatech	890101
Oznaczanie białka metodą Bradforda	Bio-Rad	500-0006
Karbonylocyjanek p-trifluorometoksyfenylohydrazony (FCCP)	Sigma-Aldrich	C2920
Wirówka 5804R	Eppendorf
Sprężony azot	Lokalny dostawca gazu
D-mannitol	Sigma-Aldrich	M9647
Kwas etylenoglikolobis(tetraoctowy) (EGTA)	Sigma-Aldrich	E3889
Kwas etylenodianmiotetraoctowy (EDTA)	Bio-Rad	161-0728
Albumin seryjny bydlęcy z wolnymi kwasami tłuszczowymi	Sigma-Aldrich	A8806
Kwas glutaminowy	Sigma-Aldrich	G5889
sól sodowa HEPES	Sigma-Aldrich	H7006
Isotemp 3006D	Fisher Scientific
Chlorek magnezu	Sigma-Aldrich	M8266
Samce szczurów Sprague Dawley	Harlan Laboratories	300–500 g
Kwas jabłkowy	Sigma-Aldrich	M9138
Mikrowirówka	ISC Bioexpress	C1301P
Oligomycyna	Sigma-Aldrich	O4876
Tarcza elektrody tlenowej	Hansatech	S1
Oksygraf	Hansatech
Oprogramowanie Oxygraph Plus V1.01	Hansatech
pH-metr	Mettler Toledo	1225506149
Bufor fosforanowy (PBS)	Sigma-Aldrich	P4417
Chlorek potasu	Sigma-Aldrich	P3911
Fosforan potasu	Sigma-Aldrich	P8416
homogenizatory Potter-Elvehjem	Fisher Scientific	08-414-14A
PTFE (0,0125 mm × membrana 25 mm)	Hansatech	S4
wiertarka stołowa SKIL 3320	Sklep z artykułami budowlanymi
Sacharoza	Sigma-Aldrich	S5016