Izolacja mitochondriów od mięśni szkieletowych

Podsumowanie

Ten protokół opisuje procedurę badania oddychania mitochondriów odizolowanych od mięśni szkieletowych. Metoda ta została zaadaptowana z Scorrano et al. (2007). Procedura izolacji mitochondriów trwa około 2 godzin. Oddychanie mitochondrialne można zakończyć w ciągu około 1 godziny.

Streszczenie

Mitochondria to organelle kontrolujące życie i śmierć komórki. Uczestniczą w kluczowych reakcjach metabolicznych, syntetyzują większość ATP i regulują szereg kaskad sygnałowych^2,3. Dawni i obecni badacze wyizolowali mitochondria z tkanek szczurów i myszy, takich jak wątroba, mózg i serce^4,5. W ostatnich latach wielu badaczy skupiło się na badaniu funkcji mitochondriów mięśni szkieletowych.

Tutaj opisujemy metodę, którą z powodzeniem wykorzystaliśmy do izolacji mitochondriów od mięśni szkieletowych ⁶. Nasza procedura wymaga, aby wszystkie i odczynniki były świeże i potrzebowały około 250-500 mg mięśni szkieletowych. Badaliśmy mitochondria wyizolowane z mięśnia brzuchatego łydki i przepony szczurów i myszy oraz mięśni zewnątrzgałkowych szczura. Stężenie białka mitochondrialnego mierzy się za pomocą testu Bradforda. Ważne jest, aby próbki mitochondrialne były przechowywane w lodowatej temperaturze podczas przygotowania i aby badania funkcjonalne były wykonywane w stosunkowo krótkim czasie (~1 godzina). Oddychanie mitochondrialne mierzy się za pomocą polarografii z elektrodą typu Clark (system oksygraficzny) w temperaturze 37°C⁷. Kalibracja elektrody tlenowej jest kluczowym krokiem w tym protokole i musi być wykonywana codziennie. Wyizolowane mitochondria (150 μg) dodaje się do 0,5 ml buforu doświadczalnego (EB). Oddychanie w stanie 2 rozpoczyna się od dodania glutaminianu (5 mM) i jabłczanu (2,5 mM). Następnie dodaje się difosforan adenozyny (ADP) (150 μM) do stanu początkowego 3. Oligomycyna (1 μM), bloker syntazy ATPazy, służy do oszacowania stanu 4. Na koniec dodaje się cyjanek karbonylu p-[trifluorometoksy]-fenylo-hydrazon (FCCP, 0,2 μM) do stanu pomiaru 5 lub oddychania niesprzężonego ⁶. Współczynnik kontroli oddechowej (RCR), stosunek stanu 3 do stanu 4, jest obliczany po każdym eksperymencie. RCR ≥4 jest uważany za dowód na żywotny preparat mitochondriów.

Podsumowując, przedstawiamy metodę izolacji żywotnych mitochondriów z mięśni szkieletowych, która może być wykorzystana w badaniach biochemicznych (np. aktywność enzymów, immunodetekcja, proteomika) i funkcjonalnych (oddychanie mitochondrialne).

Protokół

1. Przygotowanie

1. Włączyć wirówkę 5804R i ustawić na 4°C. Włączyć łaźnię wodną Isotemp 3006D i ustawić na 37°C.
2. Przed izolacją mięśni przygotuj następujące roztwory:
   • PBS: Rozpuść tabletki soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) w wodzie destylowanej (5 tabletek/litr). Dobrze wymieszaj.
   • PBS plus 10 mM EDTA: Aby przygotować 100 ml roztworu, dodać 2 ml 500 mM EDTA do 98 ml PBS.
   • 8X Bufor mitochondriów: 10,28 g sacharozy dla końcowego stężenia 0,6 M, 400 mg albuminy surowicy bydlęcej wolnego kwasu tłuszczowego (BSA) dla końcowego stężenia 0,8%, 2,08 g HEPES dla końcowego stężenia 160 mM, pH do 7,4 i QS do 50 ml z wodą destylowaną.
   • Bufor izolacyjny 1 (IB1): Dodać 200 μl 500 mM EDTA dla końcowego stężenia 10 mM, 0,392 g D-mannitolu dla końcowego stężenia 215 mM, 1,25 ml buforu mitochondrialnego 8X, pH do 7,4 i QS do 10 ml z wodą destylowaną.
   • Bufor izolacyjny 2 (IB2): Dodać 60 μl 500 mM EGTA dla końcowego stężenia 3 mM, 0,392 g D-mannitolu dla końcowego stężenia 215 mM, 1,25 ml buforu mitochondrialnego 8X, pH do 7,4 i QS do 10 ml z wodą destylowaną.
   • Bufor doświadczalny (EB): Dodać 100 μl z 500 mM MgCl₂ dla końcowego stężenia 5 mM, 0,392 g D-mannitolu dla końcowego stężenia 215 mM, 25 μl z 2,5 mM KH₂PO₄ dla końcowego stężenia 6,25 μM, 2 μl ze 100 mM EGTA dla końcowego stężenia 20 μM, 1,25 ml buforu mitochondrialnego, pH do 7,4 i QS do 10 ml z wodą destylowaną.

2. Izolacja mięśni

1. W wiaderku z lodem umieść na lodzie trzy zlewki o pojemności 10 ml, młynki do tkanek Potter-Elvehjem i wszystkie inne niezbędne instrumenty/materiały. Wszystko musi pozostać lodowate przez cały czas trwania eksperymentu.
2. Po zakończeniu umieść IB1 i IB2 w wiaderku z lodem, a EB w łaźni wodnej z ciepłą wodą.
3. Do trzech zlewek o pojemności 10 ml należy dodać następujące roztwory:
   • Zlewka 1: 10 ml PBS
   • Zlewka 2: 10 ml PBS/EDTA
   • Zlewka 3: 3 ml IB1
4. Zabij szczura w sposób humanitarny, zgodnie z aprobatą lokalnego Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami i Ich Wykorzystywania.
5. Szybko wyizolować 250-500 mg mięśni szkieletowych, wypłukać w zlewce 1, a następnie przenieść do zlewki 2.

3. Homogenizacja/Izolacja mitochondriów

1. Przenieś mięsień do zlewki 3 i drobno zmiel mięsień nożyczkami.
2. Przenieść roztwór do homogenizatora Potter-Elvehjem. Homogenizuj mięsień za pomocą zmotoryzowanego tłuczka (wiertarka załatwi sprawę) 10 razy, trzymając rurkę w lodzie przez cały czas.
3. Przenieść homogenat do wstępnie schłodzonych probówek do mikrowirówek o pojemności 2 ml i wirować przy 700 g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
4. Przenieść supernatant do nowej, wstępnie schłodzonej probówki do mikrowirówki. Wyrzuć granulkę.
5. Odwirować supernatant o stężeniu 10 500 g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
6. Przenieść supernatant do nowej, wstępnie schłodzonej probówki mikrowirówkowej i oznaczyć SN1 (supernatant numer 1) oraz typ mięśnia.
7. Ponownie zawiesić granulat w 500 μl IB2.
8. Wirować przy 10 500 g przez 10 minut w temperaturze 4°C.
9. Przenieść supernatant do nowej, wstępnie schłodzonej probówki do mikrowirówki i oznaczyć SN2 (supernatant numer 2) oraz typ mięśnia.
10. Zawiesić końcowy osad mitochondrialny w 100 μl IB2.
11. Ponownie odkręć końcową zawiesinę mitochondrialną w minifuge przez kilka sekund. Jeśli jest osad, przenieś supernatant do nowej, wstępnie schłodzonej probówki do mikrowirówki i wyrzuć osad.
12. Określ stężenie białka za pomocą testu Bradforda ⁸.

4. Kalibracja elektrody

UWAGA: Zakończ kalibrację elektrody podczas izolacji mitochondrialnej.

1. Dodać 100 ml wody destylowanej do kolby o pojemności 250 ml. Mieszaj energicznie przez 20 minut, aby zrównoważyć wodę z gazem atmosferycznym.
2. Dodaj kilka kropli 50% KCl do elektrody Oxygraph.
3. Umieść mały kawałek papieru do zwijania Blue Rizla na elektrodzie.
4. Umieść kawałek membrany PTFE na wierzchu bibułki.
5. Nałożyć pierścień wewnętrzny za pomocą aplikatora pierścieniowego, a następnie umieścić pierścień zewnętrzny w rowku elektrody.
6. Podłącz elektrody i zmontuj resztę sprzętu: większą plastikową podstawę pierścieniową, komorę mitochondrialną i węże wodne.
7. Włącz urządzenia Oxygraph i uruchom oprogramowanie Oxygraph.
8. Dodaj zrównoważoną wodę do komory mitochondrialnej.
9. Dodaj mieszadło i włącz do prędkości 60.
10. Rozpocznij nowy eksperyment.
11. Kliknij kalibrację, a następnie kalibrację fazy ciekłej dla pola 1. Zmień temperaturę na 37° C i dwukrotnie kliknij "OK".
12. Gdy "Zastąp" zmieni się na "OK", kliknij go i otwórz zbiornik azotu.
13. Umieść końcówkę podłączoną do zbiornika azotu w komorze i ustal zero tlenu. Kliknij "OK", gdy przełączy się z "Zastąp".
14. Odessać wodę i dodać 500 μl buforu EB do komór mitochondrialnych.
15. Komora uszczelniająca z tłokiem.
16. Jeśli używasz wielu pudełek, powtórz kroki 11-15, aby skalibrować pudełko 2.

5. Oddychanie mitochondrialne

1. Rozpocznij nowy eksperyment; pozwól mu działać przez około 1 minutę, aby ustabilizować sygnał.
2. Dodać niezbędną objętość zawiesiny mitochondrialnej (krok 3.11) dla 150 μg w każdej komorze, zaznaczyć zdarzenie i pozostawić na 1 minutę.
3. Dodać 10 μl ciepłego 250 mM/125 mM glutaminianu/jabłczanu, aby uzyskać końcowe stężenie 5 mM/2,5 mM. Zaznacz i pozwól działać przez 1 minutę. Jest to zdefiniowane jako stan 2.
4. Dodać 7,5 μl 10 mM ADP, aby uzyskać końcowe stężenie 150 μM, oznaczyć i pozostawić na 30 sekund. Jest to zdefiniowane jako stan 3.
5. Dodaj kolejne 7,5 μl 10 mM ADP, zaznacz i pozostaw na 1,5 minuty.
6. Dodać 0,5 μl zimnej oligomycyny 10 mM do końcowego stężenia 1 μM, oznaczyć i pozostawić na 3 minuty. Jest to zdefiniowane jako stan 4.
7. Dodać 1 μl zimnego 0,1 mM FCCP do końcowego stężenia 0,2 μM, zaznaczyć i odstawić na 3 minuty. Jest to zdefiniowane jako stan 5.
8. Po zakończeniu zakończ eksperyment i zapisz.
9. Pomiar częstości oddechów za pomocą oprogramowania Oxygraph.
10. Wprowadź współczynnik normalizacji: jeśli dodasz 150 μg białka mitochondrialnego, współczynnik normalizacji wyniesie 0,15.
11. Oblicz znormalizowane częstości oddechów dla różnych stanów oddychania.
12. Oblicz współczynnik kontroli oddechowej (RCR), dzieląc stan 3 przez stan 4.

6. Reprezentatywne wyniki:

Rysunek 1. pokazuje reprezentatywne śledzenie zużycia tlenu przez mitochondria mięśni szkieletowych. Po ustabilizowaniu sygnału elektrody próbka mitochondriów jest dodawana do komory oksygraficznej. Oddychanie w stanie 2 rozpoczyna się od dodania glutaminianu i jabłczanu. Dodatek ADP zwiększa zużycie tlenu, definiując stan oddychania 3. Syntaza ATP jest blokowana przez dodanie oligomycyny w celu uzyskania oddychania w stanie 4. Na koniec dodaje się FCCP w celu rozłączenia oddychania mitochondrialnego (stan 5). Tabela 1 przedstawia reprezentatywne wskaźniki zużycia tlenu dla stanów 2, 3, 4 i 5. Współczynnik kontroli oddechowej (RCR) jest obliczany dla każdego eksperymentu. RCR ≥4 jest uważany za dowód na istnienie żywotnego preparatu mitochondriów.

Państw Znormalizowane stawki Stan 2 Rejon 34,74 Stan 3 153,40 zł Stan 4 godz. 16.49 Stan 5 143,70 zł RCR (Rejestr zagrożeń) godz. 9.30

Tabela 1. Częstość oddychania mitochondrialnego. Reprezentatywne wskaźniki zużycia tlenu z mitochondriów mięśni szkieletowych. Wartości są normalizowane do ilości mitochondriów dodanych do komory. Współczynnik kontroli oddechowej (RCR) określa się przez podzielenie stanu 3 przez stan 4. RCR≥4 reprezentuje żywotny preparat mitochondriów.

Dyskusja

Przedstawiamy protokół izolacji żywotnych mitochondriów od mięśni szkieletowych. Jeśli wydajność jest problemem, protokół można zmodyfikować, inkubując izolowany mięsień w 5 ml PBS/10mM EDTA/0,01% trypsyny przez 30 minut w lodzie. Aby zapewnić pełne trawienie mięśni za pomocą trypsyny, mięsień musi być w pełni zmielony. Po 30-minutowej inkubacji PBS/10mM EDTA/0,01% roztwór trypsyny musi być całkowicie zastąpiony 3 ml buforu izolacyjnego 1 (IB1). Ponadto stosowanie trypsyny może zakłócać działanie niektórych substratów mi...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
95% CO2 / 5% mieszanki O2	Lokalny dostawca
Sól sodowa adenozyny 5′-difosforanu	Sigma-Aldrich	A2754
Niebieski papier Rizla	Hansatech	890101
Bradford	Bio-Rad	500-0006
Cyjanek karbonylu p-trifluorometoksyfenylohydrazon (FCCP)	Sigma-Aldrich	C2920
Wirówka 5804R	Eppendorf
Sprężony azot	Lokalny dostawca
gazu D-mannitol	Sigma-Aldrich	M9647
Kwas glikol-etylenowo-bis-tetraoctowy (EGTA)	Sigma-Aldrich	E3889
Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)	Bio-Rad	161-0728
Wolne kwasy tłuszczowe albumina surowicy bydlęcej	Sigma-Aldrich	A8806
Kwas glutaminowy	Sigma-Aldrich	G5889
Sól sodowa HEPES	Sigma-Aldrich	H7006
Isotemp 3006D	Fisher Scientific
Chlorek	magnezuSigma-Aldrich	M8266
Samiec Sprague Dawley Rats	Harlan Laboratories	300-500g
Kwas jabłkowy	Sigma-Aldrich	M9138
Minifuge	ISC Bioexpress	C1301P
Oligomycyna	Sigma-Aldrich	O4876
Dysk elektrody tlenowej	Hansatech	S1
Oxygraph	Hansatech
Oxygraph Plus V1.01	Hansatech
	Mettler Toledo	1225506149
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)	Sigma-Aldrich	P4417
Chlorek potasu	Sigma-Aldrich	P3911
Fosforan potasu	Sigma-Aldrich	P8416
Homogenizatory Potter-Elvehjem	Fisher Scientific	08-414-14A membrana
PTFE (0,0125mm × 25mm)	Hansatech	S4
SKIL 3320	Sklep
Sacharoza	Sigma-Aldrich	S5016