Disekcja elementów ludzkiego ciała szklistego do analizy proteomicznej

Podsumowanie

Niniejszy film przedstawia skuteczną technikę różnicowania i preparowania poszczególnych półprzezroczystych struktur ciała szklistego ludzkiego oka w materiale pośmiertnym.

Streszczenie

Ciało szkliste jest optycznie przejrzystą, kolagenową macierzą zewnątrzkomórkową, która wypełnia wnętrze oka i pokrywa siatkówkę. ^1,2 Nieprawidłowe oddziaływania między podstrukturami ciała szklistego a siatkówką leżą u podstaw wielu chorób witreoretinalnych, w tym pęknięć i odwarstwienia siatkówki, zmarszczki plamki, otworu plamki, zwyrodnienia plamki związanego z wiekiem, trakcji witreomakularnej, proliferacyjnej witreoretinopatii, proliferacyjnej retinopatii cukrzycowej oraz dziedzicznych witreoretinopatii. ^1,2 Skład molekularny podstruktur ciała szklistego nie jest znany. Ponieważ ciało szkliste jest przezroczyste i ma ograniczony dostęp chirurgiczny, badanie jego podstruktur na poziomie molekularnym było trudne. Opracowaliśmy metodę separacji i konserwacji tych tkanek do analiz proteomicznych i biochemicznych. Technika sekcji zaprezentowana w tym filmie eksperymentalnym pokazuje, jak wyizolować podstawę ciała szklistego, błonę hialoidową przednią, rdzeń ciała szklistego oraz korę ciała szklistego z pośmiertnych ludzkich oczu. Jednowymiarowe analizy SDS-PAGE każdego z komponentów ciała szklistego wykazały, że zastosowana technika sekcji pozwoliła na uzyskanie czterech unikalnych profili białkowych odpowiadających każdej podstrukturze ludzkiego ciała szklistego. Identyfikacja białek różnicowo rozmieszczonych w poszczególnych przedziałach pozwoli na wskazanie cząsteczek kandydackich leżących u podstaw różnych chorób witreoretinalnych.

Protokół

1. Disekcja przedniego odcinka oka.

1. Rogówkę usuwa się, wykonując najpierw nacięcie w obrębie limbusa do komory przedniej za pomocą ostrza 15° (Rysunek 1). Następnie jedno ostrze zakrzywionych nożyczek rogówkowo-twardówkowych wprowadza się do komory przedniej. W rogówce, bezpośrednio przed limbusem, wykonuje się cięcia okrężne.
2. Do okrężnego wycięcia tęczówki przed ciałem rzęskowym używa się pęsety Colibri 0.12 oraz nożyczek Westcotta.
3. Jądro soczewki usuwa się pęsetą Colibri 0.12 lub ostrzem 15° (supersharp), a korę i torebkę pęsetą.

2. Aspiracja rdzenia ciała szklistego.

1. Igłę 23G osadzoną na strzykawce 5-cc wprowadza się do środkowej części ciała szklistego (Rycina 1).
2. Delikatnie aspiruje się około 1 mL lub więcej rdzenia ciała szklistego.
3. Próbkę umieszcza się w probówce do mikrowirówki, a następnie w ciekłym azocie.

3. Przednia sekcja ciała szklistego.

1. Przednią błonę szklistą widoczne jest jako półprzezroczysty pierścień po dostosowaniu światła padającego z oświetlenia mikroskopowego z tzw. „gęsiej szyi”. Wcześniejsza aspiracja rdzenia ciała szklistego oddziela przednią błonę szklistą od innych struktur, co ułatwia jej identyfikację.
2. Warstwę tkanki elastycznej ostrożnie oddziela się od ciała rzęskowego za pomocą pęsety Colibri lub pęsety anatomicznej, a następnie przecina nożyczkami Vannasa. Manewr ten należy powtórzyć.
3. Próbkę umieszcza się w probówce do wirówki, a następnie w ciekłym azocie.

4. Disekccja podstawy ciała szklistego.

1. Za pomocą pęsety 0,12 stabilizuje się oczkodopełniacz, a następnie używa się nożyczek Westcotta, aby „rozkwitnić” oko, wykonując cztery równomiernie rozmieszczone nacięcia odciążające od ciała rzęskowego w kierunku główki nerwu wzrokowego.
2. Z każdego z kwadrantów za pomocą nożyczek Westcotta usuwa się pars plicata ciała rzęskowego (Rysunek 2).
3. Następnie pęsetą chwyta się podstawę ciała szklistego po obu stronach ora serrata, nad pars plana i siatkówką (Rysunek 2).
4. Za pomocą pęsety wywiera się ciągły nacisk na podstawę ciała szklistego. Sekwencyjne cięcie nożyczkami Westcotta pozwala na wycięcie półprzezroczystej tkanki o wyglądzie „sznura pereł”.
5. Próbkę umieszcza się następnie w probówce do mikrowirówki, a potem w ciekłym azocie.

5. Usunięcie kory ciała szklistego.

1. Pars plana jest wycinana z każdego z kwadrantów za pomocą nożyczek Westcotta poprzez przecięcie płata w odległości około 3 mm za ora serrata (Rysunek 2).
2. Pomiędzy płatami tkanki kora ciała szklistego jest widoczna jako półprzezroczysta błona.
3. Elastyczna błona jest chwytana pęsetą 0.12 lub utrzymywana dzięki przyleganiu do gąbki chirurgicznej Weck-Cel. Następnie kora ciała szklistego jest odciągana od siatkówki i wycinana nożyczkami Westcotta (Rysunek 1).
4. Próbkę umieszcza się w probówce do mikrowirówki, a następnie w ciekłym azocie. Wszystkie próbki są przechowywane w temperaturze -80° C do czasu wykorzystania w eksperymentach.

6. Reprezentatywne wyniki

Próbki tkanek można przetwarzać za pomocą różnych metod w zależności od konkretnych eksperymentów. W naszym przypadku próbki przekazano do analizy białek metodą SDS-PAGE (Rysunek 3).

Rycina 1. Przekrój poprzeczny ludzkiego oka przedstawiający poszczególne podstruktury ciała szkłowatego. Przednia część ciała szkłowatego to cienka warstwa kolagenowa nazywana przednią błoną szkłowatą. Rdzeń ciała szkłowatego obejmuje cały obszar centralny ciała szkłowatego. Ta część ciała szkłowatego ma charakter bardziej wodnisty w przeciwieństwie do podstawy ciała szkłowatego, która jest na tyle lepka, że można ją uchwycić pęsetą, i jest silnie przytwierdzona do leżącego poniżej ciała rzęsowego oraz siatkówki. Rdzeń ciała szkłowatego jest otoczony bardzo cienką kolagenową powłoką zwaną korą ciała szkłowatego.

Rysunek 2. Anatomia podstawy ciała szklistego. Podstawa ciała szklistego to półprzezroczysta podstruktura ciała szklistego zlokalizowana wzdłuż ora serrata (białe strzałki), która stanowi linię podziału oddzielającą ciało rzęskowe od siatkówki. Przednia granica podstawy ciała szklistego rozciąga się nad pars plana (biała linia) ciała rzęskowego. Tylna granica podstawy ciała szklistego sięga 2-3 mm za ora serrata (biała przerywana linia). Aby wyciąć podstawę ciała szklistego, należy użyć pęsety do uchwycenia tkanki i odciągnięcia jej od leżącego poniżej ciała rzęskowego oraz siatkówki. Po uniesieniu tkanki używa się nożyczek Westcotta do cięcia wzdłuż podstawy.

Rycina 3. Jednowymiarowa elektroforeza SDS-PAGE elementów ciała szklistego. Całkowite stężenia białek dla przedniej błony szklistej, podstawy ciała szklistego, rdzenia ciała szklistego oraz kory ciała szklistego wynosiły odpowiednio 11,24, 20,1, 16,61 i 14,24 mg/mL. Elektroforezę żelową przeprowadzono przy napięciu 200 kV przez 45 minut, barwiono barwnikiem Flamingo (Bio-Rad) i wizualizowano za pomocą systemu obrazowania VersaDoc (Bio-Rad). Profile dla różnych tkanek wykazują kilka podobnych pręg, co wskazuje na obecność białek konserwowanych lub zanieczyszczeń krzyżowych, a także pręgi unikatowe (gwiazdka), wskazujące na białka zlokalizowane różnicowo.

Dyskusja

Ciało szkliste jest półprzezroczystym żelem, którego skład molekularny jest słabo poznany, zwłaszcza na poziomie jego podstruktur: podstawy szklistej, rdzenia, kory oraz przedniego odcinka błony szklistej. Rdzeń ciała szklistego zawiera kolageny II, V, IX i XI, a także proteoglikany siarczanu chondroityny, proteoglikany siarczanu heparanu oraz kwas hialuronowy.^1,2 Biomarkery białkowe w rdzeniu ciała szklistego powiązano z chorobami takimi jak retinopatia cukrzycowa.^3-5 Nie wiadomo, w jaki sposób białka te wykazują różnicową ekspresję w każdej z podstruktur, a w wielu przypadkach nieznana jest tożsamość konkretnych białek. Szczegóły te mogą rzucić światło na pochodzenie białek związanych z konkretnymi chorobami witreoretinalnymi i pomóc w celowaniu w przyszłe terapie. Chociaż nie określono optymalnego odstępu czasu po śmierci dla sekcji tkanek, degradacja białek może wpłynąć na późniejsze eksperymenty. Na przykład immunohistochemia jest zaburzona w oczach po 12 godzinach od śmierci, a aktywność niektórych specyficznych enzymów może spaść w ciągu kilku godzin (obserwacja niepublikowana). Wszystkie tkanki w niniejszym badaniu pobrano od 2 do 8 godzin po śmierci, bez istotnych zmian w ekspresji białek lub przydatności do analiz proteomicznych. Metodę mrożenia w ciekłym azocie wybrano zamiast fiksacji, aby zapobiec niewielkim zmianom w strukturze białek spowodowanym sieciowaniem przez utrwalacz, co wykazano w innych tkankach za pomocą LC-MS/MS.⁶ Badania proteomiczne będą zależeć od zdolności do dokładnej sekcji różnych przedziałów ciała szklistego, co zaprezentowano w niniejszym eksperymencie wideo. Zweryfikowaliśmy technikę sekcji za pomocą 1-wymiarowej elektroforezy SDS-PAGE. Jak sugerują nasze wyniki, w różnych podstrukturach ciała szklistego występują białka o różnicowej ekspresji. Identyfikacja tych białek pozwoli na dokładniejsze zrozumienie kompartymentacji ciała szklistego.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
pinceta 0,12	Storz Ophthalmics	E1502
strzykawka 5 cc	BD Biosciences	309603
proste pincety opatrunkowe z ząbkami	Storz Ophthalmics	E1400
igła 23 G	BD Biosciences	305145
pinceta Colibri	Storz Ophthalmics	2/132
kątowe nożyczki rogówkowe Castroviejo	Storz Ophthalmics	E3223
zakrzywione nożyczki do kapsulotomii Vannas	Storz Ophthalmics	E3387
chirurgiczne patyczki Weck-Cel	Medtronic Inc.	0008680
zakrzywione nożyczki do tenotomii Westcott	Storz Ophthalmics	E3320