Opracowanie metod badania transportu nanoformułowanych leków antyretrowirusowych przez makrofagi w krwiobiegu

Podsumowanie

Nanocząsteczki indynawiru, rytonaviru, efawirenzu i atazanawiru zostały wytworzone przy użyciu mokrego mielenia, homogenizacji i sonikacji. Te nanoformulacje, określane wspólnie jako nanoformułowana terapia antyretrowirusowa (nanoART), posłużyły do oceny dostarczania leków za pomocą makrofagów. Określono stopień pobierania, retencji i przedłużonego uwalniania nanoART przez makrofagi pochodzące z monocytów. Te wstępne badania sugerują potencjał nanoART do zastosowań klinicznych.

Streszczenie

Leki w formie nanoformułacji mogą poprawić farmakodynamikę i biodostępność, służąc jednocześnie redukcji toksyczności leków w terapii antiretroviralnej (ART). W tym celu nasze laboratorium zastosowało zasady nanomedycyny w celu uproszczenia schematów leczenia ART, a tym samym zmniejszenia toksyczności przy jednoczesnej poprawie przestrzegania zaleceń terapeutycznych oraz farmakokinetyki leków. Przedstawiono proste i niezawodne metody wytwarzania nanoformułowanych leków ART (nanoART). Cząsteczki czystego leku są enkapsulowane w cienkiej warstwie powłoki lipidowej z surfaktantu i wytwarzane poprzez frakcjonowanie większych kryształów leku na mniejsze, wykorzystując mielenie na mokro lub homogenizację wysokociśnieniową. W alternatywnej metodzie wolny lek jest zawieszony w kropli polimeru. W tym przypadku lek rozpuszczany jest w polimerze, a następnie poddawany sonikacji do momentu utworzenia się pojedynczych kropli o rozmiarach nanometrycznych. Dynamiczne rozpraszanie światła oraz badanie mikroskopowe służą do charakterystyki właściwości fizycznych cząsteczek (rozmiaru cząstek, ładunku i kształtu). Ich właściwości biologiczne (wychwyt i retencja komórkowa, cytotoksyczność oraz skuteczność antiretroviralna) są określane z wykorzystaniem makrofagów pochodzących z ludzkich monocytów (MDM). MDM pochodzą z monocytów krwi obwodowej człowieka, izolowanych z leukopaków przy użyciu elutracji odśrodkowej w celu oczyszczenia. Takie makrofagi pochodzenia krwi mogą być wykorzystywane jako transportery komórkowe do dystrybucji nanoART do organów zainfekowanych wirusem niedoboru odpornościowego (HIV). Zakładamy, że ponowne sformułowanie dostępnych klinicznie leków antiretroviralnych w postaci nanocząsteczek do leczenia HIV-1 może poprawić przestrzeganie zaleceń terapeutycznych i pozytywnie wpłynąć na wyniki leczenia choroby.

Protokół

Produkcja NanoART

1. Metody mielenia na mokro NanoART opracowane przez NETZSCH MicroCer

1. Odważyć kryształy leku oraz poszczególne surfaktanty, które zostaną użyte do przygotowania nanoformulacji, korzystając z wagi analitycznej, a następnie wymieszać je z 10 mM buforem Hepes, pH 7.8 za pomocą mieszadła T-18 Ultraturrax aż do całkowitego rozproszenia. Zawartość leku w formulacji powinna wynosić od 1 do 2%.
2. W przypadku mielenia ciągłego upewnić się, że chłodziarka i kompresor są włączone. Przed rozpoczęciem mielenia próbki ciśnienie wylotowe powinno wynosić około 100 PSI.
3. Włączyć jednostkę sterującą i obrócić zbiornik mielący, aby umożliwić załadowanie mediów mielących do zbiornika.
4. Za pomocą lejka dodać 50 mL kulek do komory mielącej. Upewnić się, że w gwintach lub w jakimkolwiek miejscu poza komorą mielącą nie znajdują się kulki, aby uniknąć nieszczelności uszczelnienia mechanicznego.
5. Upewnić się, że o-ring znajduje się na swoim miejscu w komorze mielącej. Wybrać odpowiednią wielkość oczek sita, użyć odpowiedniego zestawu pokrywy i zabezpieczyć pokrywy, dokręcając nakrętki. Wielkość oczek sita powinna stanowić co najmniej połowę średnicy kulek. Należy zastosować duże oczka sita, aby zapobiec zapychaniu filtra podczas mielenia ciągłego.
6. Obniżyć komorę mielącą do pozycji poziomej za pomocą pokrętła znajdującego się na górze komory i upewnić się, że rurka wylotowa produktu odprowadza zawartość do naczynia zbierającego.
7. Dodać zawiesinę leku z różnymi ilościami surfaktantów do wlotu produktu. Minimalna objętość zawiesiny powinna wynosić 100 mL. Zapobiegnie to przegrzaniu komory mielącej oraz uniknie zanieczyszczenia kulek dzięki mniejszemu zużyciu części.
8. Uruchomić pompę za pomocą jednostki sterującej. Natężenie przepływu można dostosować zgodnie z wymaganiami dla danej formulacji (~ 50 - 150 mL/min).
9. Włączyć mieszadło i ustawić prędkość na jednostce sterującej. W urządzeniu MicroCer prędkość można zwiększyć z 620 rpm do 4320 rpm. Monitorować temperaturę za pomocą manometru temperatury zamontowanego na górze komory mielącej i upewnić się, że nie dochodzi do przegrzania.
10. Mielić próbkę przy różnych prędkościach i natężeniach przepływu, pobierając małe alikwoty (~1 mL) formulacji do pomiarów wielkości i ładunku za pomocą analizatora Diffraction Light Scattering Brookhaven Zetasizer (Tabela 1).
11. Po uzyskaniu pożądanej wielkości zatrzymać mielenie za pomocą jednostki sterującej. Przy wciąż włączonej pompie zebrać próbkę do kolby. Pozwolić lekowi całkowicie spłynąć do kolby zbierającej próbki.
12. Wyłączyć pompę. Aby usunąć kulki, umieścić tackę zbierającą pod urządzeniem. Poluzować nakrętki na przedniej płycie zestawu pokrywy i zebrać kulki do tacki. Zdjąć przednią płytę i użyć butelki z wodą dejonizowaną, aby wypłukać kulki do tacki.
13. Przenieść zmieloną zawiesinę do probówek wirówkowych 50 mL i ustawić wirówkę na 10,000 rpm (10,174 rcf) na 30 minut. Po zakończeniu cyklu wirowania zmierzyć objętość supernatantu i zastąpić ją taką samą ilością świeżego roztworu surfaktantu.
14. Po zakończeniu resuspensji przenieść zawiesinę do komory mielącej i mielić przez 10 minut. Pobrać alikwot (~ 1mL) i ponownie zmierzyć wielkość oraz ładunek próbki za pomocą Zetasizera (Tabela 1).
15. Przeprowadzić czyszczenie urządzenia MicroCer po użyciu, stosując wodę dejonizowaną i 70% etanol.
16. Zmierzyć stężenie nanoformulacji nanoART przy użyciu HPLC. W naszym przypadku próbki analizowano metodą HPLC w fazie odwróconej, stosując potrójne wstrzyknięcia 20 μL na kolumnę YMC Octyl C8 (Waters Inc., Milford, MA) z wkładem ochronnym C8. Fazę ruchomą składającą się z 48% acetonitrylu / 52% 25mM KH₂PO₄, pH 4.15 pompowano z szybkością 0.4 mL/min z detekcją UV/Vis przy 272 nm. Dla wszystkich pomiarów leku ilość określano poprzez porównanie z krzywą wzorcową każdego wolnego leku (0.025-100 μg/ mL) przygotowaną w metanolu.

2. Homogenizacja NanoART przy użyciu Avestin EmulsiFlex C5

1. Odważ kryształy leku oraz poszczególne surfaktanty, które zostaną wykorzystane do przygotowania nanoformulacji, używając wagi analitycznej, a następnie zmieszaj je z buforem Hepes 10 mM o pH 7,8 za pomocą mieszadła T-18 Ultraturrax, aby uzyskać pełną dyspersję.
2. Przenieś zawiesinę do naczynia homogenizującego i rozpocznij recyrkulację. Przed rozpoczęciem homogenizacji próbki upewnij się, że chłodziarka jest włączona.
3. Stopniowo zwiększaj ciśnienie, aż miernik wskaże 20 000 ± 2 000 psi, i kontynuuj homogenizację do momentu uzyskania docelowego rozmiaru cząstek. Zazwyczaj zajmuje to od 45 do 60 minut. Okresowo pobieraj alikwot (~ 1 mL) i mierz rozmiar oraz ładunek próbki za pomocą Zetasizera (Tabela 1).
4. Przenieś zhomogenizowaną zawiesinę z homogenizatora do probówek wirówkowych o pojemności 50 mL i ustaw wirówkę na 10 000 rpm (10 174 rcf) na 30 minut. Po zakończeniu cyklu wirowania zmierz ilość nadnadłożnego i zastąp go równą objętością świeżego roztworu surfaktantu.
5. Po resuspensji przenieś zawiesinę do homogenizatora C5. Ponownie uruchom cyrkulację, przywróć ciśnienie homogenizacji do 20 000 ± 2 000 psi i homogenizuj przez 30 minut. Zmierz rozmiar i ładunek formulacji za pomocą Zetasizera (Tabela 1).
6. Przeprowadź czyszczenie urządzenia wodą dejonizowaną i etanolem jako rozpuszczalnikiem.
7. Zmierz stężenie próbek za pomocą metody HPLC.

3. Sonikacja z użyciem procesora ultradźwiękowego Cole Parmer

1. Odmierz 50 mL dichlorometanu do zlewki szklanej. Odważ 6 g kopolimeru kwasu mlekowego i glikolowego (PLGA) za pomocą wagi analitycznej, dodaj do dichlorometanu i mieszaj do całkowitego rozpuszczenia.
2. Odmierz 1,25 g kryształów leku i dodaj do roztworu dichlorometanu/PLGA. Mieszaj do uzyskania pełnego rozpuszczenia.
3. Przygotuj 1% roztwór surfaktanta z alkoholu poliwinylowego (PVA) i schłodź go w kąpieli lodowej. Upewnij się, że roztwór surfaktanta jest chłodny przed dodaniem roztworu organicznego zawierającego rozpuszczony lek.
4. Wlej roztwór leku do 1% roztworu surfaktanta PVA i uruchom sonikator z amplitudą 50%. Upewnij się, że roztwór surfaktanta znajduje się w kąpieli lodowej. W przypadku mniejszych partii próbek amplitudę sonikatora można zmniejszyć do około 30%. Sonicuj próbkę przez 10 minut.
5. Pobierz małą alikwot (~ 1 mL) do analizy wielkości cząstek (Tabela 1). Jeśli wielkość cząstek przekracza 1,5 μm, sonicuj próbkę w odstępach 2-minutowych do maksymalnie 16 minut łącznie. Obserwuj próbki pod mikroskopem przy powiększeniu 20x i udokumentuj obserwacje (Rysunek 1A).
6. Użyj mieszadła magnetycznego, aby wytworzyć odpowiedni wir w pozostałej zawiesinie, i kontynuuj mieszanie przez noc w temperaturze pokojowej.
7. Odważ 8 g mannitolu do kolby i dodaj 80 mL wody RO. Mieszaj do całkowitego rozpuszczenia i przechowuj w temperaturze pokojowej. Roztwór ten posłuży do resuspensji po wirowaniu, jeśli próbki będą wymagały liofilizacji.
8. Zbierz zawiesinę po 24 godzinach i przelej do probówek wirówkowych o pojemności 50 mL. Wirowuj próbki z prędkością 8 000 rpm przez 20 minut w temperaturze 5°C. Odlej nadsącz i resuspenduj jedną połowę próbki w 75 mL filtrowanej wody z odwróconej osmozy (RO), a drugą połowę w 75 mL 0,5% roztworu surfaktanta bromku cetylo trimmedekoamoniowego (CTAB).
9. Ponownie wirowuj próbki z prędkością 8 000 rpm przez 20 minut w temperaturze 5°C i resuspenduj każdy z osadów w łącznej objętości 20 mL roztworu mannitolu.
10. Po drugiej resuspensji zmierz wielkość cząstek za pomocą Zetasizer (Tabela 1).
11. Przenieś pozostałą zawiesinę do odpowiednich fiolek i umieść je w liofilizatorze.
12. Zmierz stężenie próbek za pomocą HPLC.

4. Morfologia NanoART

1. Należy pobrać zawiesinę nanoART i poddać ją krótkiej sonikacji przy amplitudzie 20% przez 5 sekund za pomocą sondy sonikacyjnej. Następnie 10 μL zawiesiny należy przenieść do 1,5 mL wody RO w probówce do mikrocentryfugi o pojemności 1,7 mL i mieszać w wirówce (vortex) przez 10 sekund.
2. Należy pobrać 50 μL próbki roztworu nanoART w wodzie i przenieść ją do aparatury filtracyjnej składającej się z polipropylowego uchwytu filtra Swinnex 13 z zamontowaną poliwęglanową membraną filtracyjną o porach 0,2 μm (Nuclepore Track-Etched). Przed dodaniem rozcieńczonej zawiesiny leku aparaturę filtracyjną należy przygotować, płucząc ją 50 μL wody destylowanej przefiltrowanej przez membranę 0,2 μm. Następnie do aparatury należy przyłożyć podciśnienie, aż cała objętość roztworu zostanie całkowicie przepuszczona przez membranę filtracyjną.
3. Po wyschnięciu membrany należy przymocować ją do aluminiowego trzpienia (stub) za pomocą dwustronnej przewodzącej taśmy węglowej i napylić palladem. Następnie preparat na trzpieniu obrazuje się za pomocą – w naszym przypadku – nisko napięciowego skaningowego mikroskopu elektronowego z emiterem polowym JEOL JSM6300F (Rysunek 2).

5. Wizualizacja NanoART

1. Przygotowane zawiesiny nanoART poddać sonikacji przez 10 sekund przy amplitudzie 20% za pomocą sondy sonikacyjnej.
2. Wziąć szkiełko nakrywki i umieścić je na mikroskopie odwróconym. Na szkiełku nakrywce zmieszać 15 μL zawiesiny nanoART z 100 μL soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS), mieszając poprzez kilkukrotne pipetowanie w górę i w dół. Nanocząstki zwizualizować przy użyciu obiektywu 20x (Rysunek 3).

Biologia nanoART

6. Izolacja i przygotowanie monocytów z krwi oraz makrofagów pochodzenia monocytarnego (MDM)

1. Pozyskać ludzkie monocyty od dawców seronegatywnych pod kątem HIV-1 i wirusowego zapalenia wątroby metodą leukaferezy, a następnie oczyścić komórki za pomocą przeciwprądowej elutracji odśrodkowej. Czystość komórek ocenić poprzez immunoznakowanie przeciwciałem anty-CD68 (klon KP-1) na preparatach cytospin barwionych metodą Wrighta 1.
2. Hodować oczyszczone monocyty w pożywce DMEM uzupełnionej o 10% inaktywowaną ciepłem pulę surowicy ludzkiej, 1% glutaminy, 50 μg/mL gentamycyny, 10 μg/mL cyprofloksacyny oraz 1000 U/mL rekombinowanego ludzkiego czynnika stymulującego kolonie makrofagów (MCSF) w stężeniu 1x10⁶ komórek/mL w temperaturze 37°C w atmosferze uwilgotnionej z 5% CO₂. Wysiać 2x10⁶ komórek na dołek w płytkach 6-dołkowych i hodować komórki przez 7 dni, aby umożliwić różnicowanie się monocytów w makrofagi 1. (Rysunek 3A)

7. Pobieranie i zbieranie komórek

1. Wymieszaj nanoART z pożywką hodowlaną (bez MCSF) do stężenia końcowego 100 μM i dodaj 1 mL pożywki z czynnikiem terapeutycznym do każdego dołka.
2. W wybranym punkcie czasowym lub po całkowitym załadowaniu nanoART do komórek (Rysunek 2), usuń całą pożywkę z czynnikiem terapeutycznym i przemyj komórki 3 razy 1 mL PBS, aby usunąć cząsteczki, które nie zostały pobrane przez komórki. Za pomocą scrapera do komórek zbierz komórki przylegające z dna dołka w 1 mL PBS i przenieś je do probówki do mikrowirówki o pojemności 1,7 mL 2-4.
3. Wiruj komórki przy 1,000 rcf w temperaturze 4°C przez 10 minut. Usuń nadsącz i dodaj 200 μL 100% metanolu. Zlizuj komórki i rozpuść nanoART, poddając osad krótkiemu (2-5 sekund) działaniu sonikatora z sondą przy amplitudzie 20%. Przechowuj próbki w temperaturze -80°C do momentu analizy zawartości leku.

8. Wewnątrzkomórkowa retencja NanoART

1. Poddać MDM działaniu zgodnie z opisem w punkcie 7.1.
2. W wybranym punkcie czasowym przemyć komórki zgodnie z opisem w punkcie 7.2; jednak zamiast natychmiastowego zeskrobania komórek, utrwalić je przez 15 min w temperaturze pokojowej w roztworze 3% glutaraldehydu w 0,1 M buforze fosforanowym (pH 7,4), a następnie utrwalić przez kolejne 10 minut przy użyciu 1% tetrautlenku osmu w 0,1 M buforze fosforanowym (pH 7,4).
3. Usunąć utrwalacz i zeskrobać komórki w 1 mL PBS zgodnie z opisem w punkcie 7.2. Następnie zebrać i odwirować komórki zgodnie z opisem w punkcie 7.2; jednak zamiast dodawania metanolu do osadu, dodać 200 μL roztworu utrwalającego z glutaraldehydem.
4. Przygotować cienkie (80 nm) przekroje osadu komórkowego za pomocą mikrotomu. Przekroje zabarwić octanem uranylu i cytrynianem ołowiu. Obserwować zabarwione przekroje przy użyciu transmisyjnego mikroskopu elektronowego (Rysunek 4).

9. Uwalnianie ART

1. Poddać komórki działaniu zgodnie z opisem w punktach 7.1-7.2; jednak zamiast zbierać komórki po przemyciu, zastąpić PBS 2 mL pożywki hodowlanej bez dodatkiem MCSF i nanoART.
2. W wyznaczone dni lub w przypadku zmiany koloru pożywki hodowlanej na żółty, wymienić połowę pożywki.
3. W wybranym dniu pobrać 1 mL pożywki komórkowej wraz z powtórzonymi próbkami komórek zgodnie z opisem w punktach 7.2-7.3.
4. Przetworzyć komórki zgodnie z opisem w punkcie 7.3. Przetworzyć pożywkę, dodając 150 μL próbki pożywki do 1 mL 100% metanolu i mieszając w wortexie z maksymalną prędkością przez 10 sekund. Następnie odwirować próbki przy 21 000 rcf przez 10 minut. Zebrać supernatant i przenieść go do nowej probówki. Odparować metanol za pomocą wirówki próżniowej; proces ten może trwać od 1 do 4 godzin w zależności od próbki. Przechowywać próbki w temperaturze -80°C do czasu przeprowadzenia analizy leków.

10. Obrazowanie pobierania NanoART w czasie rzeczywistym za pomocą mikroskopii konfokalnej

1. Pobrać dojrzałe MDM z kroku 6.2 i oznakować komórki za pomocą roztworu do znakowania komórek, takiego jak Vybrant Cell Labeling Solution, zgodnie z instrukcją producenta. Przepłukać komórki 3 razy, używając 1 mL medium hodowlanego, aby usunąć nadmiar barwnika.
2. Zmieszać nanoART z medium hodowlanym, analogicznie do kroku 7.1, stosując nanoART znakowane fluorescencyjnie.
3. Dodać medium z traktatem zawierającym znakowany nanoART bezpośrednio przed obrazowaniem za pomocą mikroskopu konfokalnego. Przechwytywać obraz co 30 sekund przez 4 godziny, używając obiektywu 60x (Filmy 1 i 2).

Badania zakaźności i infekcji HIV-1

11. Zakażenie HIV-1_ADA

1. Poddać komórki działaniu zgodnie z opisem w punktach 9.1-9.3.
2. W wyznaczonych dniach usunąć całą pożywkę i zastąpić ją pożywką bez MCSF, zawierającą HIV-1_ADA przy wielokrotności zakażenia (MOI) wynoszącej 0,01 cząsteczek wirusa/komórkę, a następnie inkubować przez 24 godziny 1. Usunąć pożywkę z wirusem i zastąpić ją świeżą pożywką wolną od wirusów. Hodować komórki przez 10 dni, wymieniając połowę pożywki co drugi dzień lub w razie potrzeby, aby utrzymać żywotność komórek (Rycina 5) 6.
3. Dziesięć dni po zakażeniu zebrać 10 μL pożywki z każdej studzienki, przenieść do płytki 96-dołkowej i przechowywać w temperaturze -80°C do czasu przeprowadzenia analizy odwrotnej transkryptazy retrowirusowej.

12. Analiza aktywności odwrotnej transkryptazy (RT)

1. Do każdej 10 μL próbki z kroku 11.3 dodać 10 μL roztworu zawierającego 100 mM Tris-HCl (pH 7.9), 300 mM KCl, 10 mM DTT, 0,1% nonyl fenoksylo polietyloetoksyetanolu-40 (NP-40) oraz wodę. Mieszaninę inkubować przez 15 minut w temperaturze 37°C 7.
2. Następnie do każdego dołka dodać 25 μL roztworu zawierającego 50 mM Tris-HCl (pH 7.9), 150 mM KCl, 5 mM DTT, 15 mM MgCl₂, 0,05% NP-40, 10 μg/mL poli (A), 0,250 U/mL oligo d(T)_12-18 oraz 10 μCi/mL ³H-TTP i inkubować w 37°C przez 18 godzin 7.
3. Po inkubacji do każdego dołka dodać 50 μL lodowatego 10% kwasu trójchlorooctowego (TCA). Zawartość dołków przenieść na filtry z włókna szklanego, a następnie ocenić wbudowanie ³H-TTP za pomocą spektroskopii β-scyntylacyjnej 7.

13. Wykrywanie HIV-1p24

1. Komórki powtórzeniowe, z których w kroku 11.3 pobrano próbkę medium do analizy odwrotnej transkryptazy retroviralnej, przemyć trzykrotnie 1 mL PBS.
2. Utrwalić komórki w 4% paraformaldehydzie przez noc w temperaturze 4°C. Następnego ranka przemyć komórki trzykrotnie PBS.
3. Do wizualizacji infekcji HIV użyć mysich przeciwciał monoklonalnych przeciwko HIV-1 p24 (1:10, Dako, Carpinteria, CA). Obrazować komórki w jasnym polu, używając obiektywu 40x (Rycina 6).

14. Reprezentatywne wyniki:

Lek	Rozmiar (nm)	PDI	Ładunek (mv)	Surfaktanty
IDV	1052	0.286	-24.58	0.5% P188, 5.0% SDS, 9.25% Sucrose
RTV	233	0.273	-7.47	0.5% P188, 9.25% Sucrose
ATZ	840	0.192	+25.47	0.5% P188, 0.1% mPEG 2000-DSPE, 1.0% DOTAP, 9.25% Sucrose
EFV	347	0.235	-13.52	1.0 % PVA

Tabela 1. Charakterystyka fizyczna nanoART
Tabela przedstawia potencjalne wartości reprezentatywne dla charakterystyki fizycznej formulacji nanoART wytworzonych przy użyciu wskazanych surfaktantów. Wartości obejmują średnicę średnią opartą na intensywności światła rozproszonego, indeks polidyspersyjności (PDI, szacunek rozkładu wielkości cząstek) oraz wartości potencjału zeta uzyskane dla różnych próbek nanostruktur. Skróty użyte w tabeli: IDV: indynawir; RTV: rytonawir; ATV: atazanawir; EFV: efawirenz; PVA: alkohol poliwinylowy; SDS: dodecylosiarczan sodu; P188: poloksamer 188 (nazywany również Pluronic F68); mPEG 2000-DSPE: metylo-poli(glikol etylenowy)1,2-distearoylo-fosfatydyloetanoloamina; DOTAP: (1-oleoil-2-[6-[(7-nitro-2-1,3-benzoksadiazol-4-yl) amino]heksanoylo]-3-trimetyloamoniowy propan.

RYSUNEK 1. Schemat blokowy podsumowujący różne metody stosowane do wytwarzania nanoART.
Rysunek 1 przedstawia różne metody wykorzystywane do produkcji nanoART. Schemat blokowy zawiera przewidywany czas przeznaczony na każdą z krytycznych faz poszczególnych metod.

RYCINA 2. Reprezentatywne obrazy pożądanej i niepożądanej morfologii NanoART. Analiza za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej (powiększenie 15 000X) nanoART RTV otrzymanych poprzez homogenizację, mielenie na mokro i sonikację na membranie filtracyjnej z poliwęglanu o rozmiarze porów 0,2 μm. Pasek skali we wszystkich klatkach wynosi 2,0 μm. Pożądane nanoART składają się średnio z małych (≤ 2 μm) odseparowanych cząstek o gładkich krawędziach, które mają tendencję do posiadania tego samego lub podobnego kształtu. Niepożądane nanoART znacznie różnią się rozmiarem i kształtem oraz mogą się łączyć i/lub przywierać do siebie.

RYCINA 3. Obrazy pożądanej zawiesiny nanoART oraz MDM pochłaniających nanoART. Obrazy mikroskopii w polu jasnym (wszystkie wykonane przy użyciu obiektywu 20x) homogenizowanych RTV-NP oraz MDM pochłaniających nanoART. Po połączeniu 10 μL roztworu RTV-NP z 100 μL PBS na szkiełku podstawowym, cząsteczki są widoczne i przypominają piasek, przy czym tylko kilka większych cząsteczek można zidentyfikować indywidualnie (A). Obraz w pełni zróżnicowanych i wrzecionowatych MDM przed traktowaniem nanoART (B). Po pochłonięciu nanoART przez komórki, stają się one ciemniejsze, a ich jądra stają się bardziej wyraźne ze względu na okojądrową dystrybucję nanoART; jednak nadal zachowują one wrzecionowaty kształt ciała komórki (C). Gdy komórki zostaną przeładowane nanoART, jądra stają się niewidoczne, a komórki przyjmują zaokrąglony kształt, tracąc strukturę wrzecionowatą i potencjalnie odrywać się od dna dołka (D).

RYSUNEK 4. Potwierdzenie wbudowania nanoART do wnętrza MDM. Transmisyjna mikroskopia elektronowa (powiększenie 15 000x) wykazuje pobranie nanoART przez MDM poddane działaniu RTV-NP otrzymanych metodą homogenizacji (A), RTV-NP otrzymanych metodą mielenia na mokro (B), RTV-NP otrzymanych metodą sonikacji (C) oraz komórki nieleczone (D). Wewnątrz komórek nanoART powinny być łatwo identyfikowalne dzięki swojemu geometrycznemu kształtowi. Zwróć uwagę na brak wyraźnych struktur geometrycznych w komórce kontrolnej (D). Obrysowano przykładowe cząstki: na czerwono dla homogenizacji (A), na niebiesko dla mielenia na mokro (B), na zielono dla sonikacji (C). Struktura cząstek powinna odpowiadać tej zaobserwowanej w SEM. Pasek skali wynosi 5.0 μm we wszystkich kadrach.

RYSUNEK 5. Schemat metody badania skuteczności przeciwwirusowej nanoART. Aby przetestować zdolność nanoART do hamowania replikacji wirusa, MDM muszą zostać najpierw potraktowane nanoART, a następnie poddane działaniu HIV-1_ADA. Podobnie jak w badaniach nad uwalnianiem ART, MDM są ładowane nanoART, a następnie przemywane w celu usunięcia cząsteczek, które nie zostały zinternalizowane. MDM obciążone nanoART są następnie hodowane do 15 dni z wymianą połowy medium co drugi dzień. W tym czasie (zazwyczaj w dniach 1, 5, 10 i 15) MDM są poddawane działaniu HIV-1_ADA. Po każdej ekspozycji na wirusa komórki są hodowane przez kolejne 10 dni, aby umożliwić postęp zakażenia. W 10. dniu po zakażeniu pobiera się próbki medium do analizy RT, a komórki są utrwalane i barwione pod kątem antygenu p24. Równolegle hodowane są również niepotraktowane nanoART komórki MDM, zarówno zakażone, jak i niezakażone, które są badane pod kątem obecności antygenu p24 i aktywności RT.

RYSUNEK 6. Badanie skuteczności nanoART w MDM zainfekowanych HIV-1 za pomocą barwienia p24. Obrazy w polu jasnym (obiektyw 20x) MDM traktowanych RTV-NP 10 dni po ekspozycji na HIV-1_ADA. Nie stwierdzono infekcji, gdy komórki zostały poddane działaniu wirusa 1 dzień po zastosowaniu nanoART (A); zwróć uwagę na obecność NP w cytoplazmie większości komórek (wstawka A wskazana strzałkami). Infekcja wystąpiła, gdy komórki zostały poddane działaniu wirusa 10 dni po zastosowaniu nanoART (B), choć w znacznie mniejszym stopniu niż w komórkach nieleczonych nanoART (D); zwróć uwagę na utrzymującą się obecność NP w niektórych komórkach (wstawka B wskazana strzałkami), jednak w mniejszej ilości niż w 1. dniu po zastosowaniu nanoART (wstawka A). Obraz komórek, które nie były traktowane nanoART ani nie zostały zainfekowane (C); zwróć uwagę na brak NP w cytoplazmie komórek (wstawka C). Obraz komórek, które nie były traktowane nanoART, ale zostały poddane działaniu HIV-1_ADA (D).

WIDEO 1. Konfokalna mikroskopia żywych komórek wykazująca słabe pobieranie RTV-NP przez MDM. Mikroskopia fluorescencyjna MDM oznakowanych na zielono za pomocą roztworu do znakowania komórek Vybrant DiO i poddanych działaniu czerwonych RTV-NP. Obrazy były rejestrowane co 30 sekund przez 4 h przy powiększeniu 60x. Kliknij tutaj, aby obejrzeć wideo

WIDEO 2. Konfokalna mikroskopia komórek żywych obrazująca skuteczne pobieranie RTV-NP przez MDM. Mikroskopia fluorescencyjna MDM oznakowanych na zielono za pomocą roztworu do znakowania komórek Vybrant DiO i poddanych działaniu RTV-NP oznakowanych na czerwono. Obrazy były rejestrowane co 30 sekund przez 4 godziny przy powiększeniu 60x. Kliknij tutaj, aby obejrzeć wideo

Dyskusja

NanoART zostały zaprojektowane w celu usprawnienia terapii HIV-1. Zaproponowaliśmy system dostarczania leków oparty na monocytach i makrofagach jako pierwszy krok w stronę opracowania takich technologii do zastosowań klinicznych oraz jako laboratoryjny system testowy do rozwoju leków w formie nanoformułacji. Nasze wcześniejsze prace wykazały, że system ten nadaje się do takiego zastosowania^5,6.

W niniejszym opracowaniu przedstawiono metody syntezy NP powszechnie stosowanych leków przeciwko HIV-1 (indynawiru, IDV; rytonawiru, RTV; efawiirenzu, EFV oraz atazanawiru, ATV). Osiągnięto to poprzez mielenie na mokro, homogenizację i sonikację. Co istotne, nasze podejście pozwala na modyfikację charakterystyk fizycznych nanoART, takich jak rozmiar, kształt i ładunek ^5,6. Poprzez staranny dobór surfaktantów można kontrolować ładunek cząsteczki w zakresie od silnie ujemnego, przez neutralny, aż po silnie dodatni. Poprzez zmianę czasu i intensywności procesu można kontrolować rozmiar, uzyskując cząsteczki o wielkości od ≤ 200 nm do ≥ 3 μm. Kształt cząsteczki również można kontrolować, choć w mniejszym stopniu niż pozostałe charakterystyki fizyczne. Na przykład cząsteczki sferyczne można wytworzyć poprzez sonikację z polimerami, natomiast wieloboczne kształty geometryczne można uzyskać za pomocą mielenia na mokro lub homogenizacji. Mielenie na mokro i homogenizacja dają cząsteczki o różnych kształtach, jednak proces ten zależy od metody frakcjonowania i nie może być bezpośrednio kontrolowany. Właściwości tych metod wytwarzania mogą umożliwić badaczom łatwe otrzymywanie nanoART zgodnie z dokładnymi specyfikacjami projektowymi. Jest to niezwykle ważne, ponieważ właściwości fizykochemiczne nanoART mają silny wpływ zarówno na ich stabilność, jak i na sposób oddziaływania z komórkami. Wykazaliśmy na przykład, że nanoART o rozmiarze około 1 μm, silnym ładunku dodatnim i wielobocznym kształcie geometrycznym są szybciej pobierane przez makrofagi, są bardziej stabilne po dostaniu się do wnętrza komórek i uwalniane w dłuższym okresie czasu 6.

Opracowano metodę testowania nanoART, która umożliwia proste badanie zdolności cząsteczek do być pobieranych, zatrzymywanych i uwalnianych przez makrofagi — jedne z głównych komórek docelowych HIV-1 — a także ich zdolności do hamowania replikacji wirusa. Pozwala to na łatwe różnicowanie nanoART na podstawie ich wydajności i zidentyfikowanie tych, które mają największą szansę na sukces w modelu in vivo, co zwiększa zarówno efektywność, jak i szybkość opracowywania nanoART do zastosowań u ludzi.

Wykazano, że makrofagi z szpiku kostnego myszy, załadowane ex vivo preparatem nanoART i przeniesione adoptywnie poprzez wtryskiwanie dożylne do myszy zhumanizowanych zainfekowanych HIV-1, mogą przemieszczać się do miejsc aktywnej infekcji, w tym do ośrodkowego układu nerwowego, i uwalniać leki przez okres do 2 tygodni w celu zahamowania replikacji wirusa^2-4. Ponadto komórki załadowane nanoART były w stanie skutecznie zredukować liczbę zainfekowanych wirusem komórek w osoczu, węzłach chłonnych, śledzionie, wątrobie i płucach, a także chronić komórki CD4+². Badania te, choć wstępne, dowodzą, że komórkowy system dostarczania nanoART może rozprowadzić klinicznie istotne ilości leku zarówno do krwi, jak i do zainfekowanych tkanek. Ze względu na obiecujące wstępne wyniki badań na myszach zainfekowanych HIV-1, obecnie opracowujemy model makaków zainfekowanych wirusem niedoboru odporności u naczelnych, aby dalej testować potencjał nanoART do zastosowań klinicznych.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Produkcja nanoART
Siarczan indynawiru	Odczynnik	Longshem Co., Szanghaj, Chiny	CAS nr 157810-81-6
Rytonawir	Odczynnik	China Shengda Pharmaceutical Company, Chiny	Nr CAS 155213-67-5
Siarczan atazanawiru	Odczynnik	Gyma Laboratories of America INC	Nr CAS 198904-31-3
Efavirenz	Odczynnik	Hetero Labs LTD, Indie	Nr CAS 154598-52-4
PVA	Odczynnik	Sigma-Aldrich	P 8136
Karta charakterystyki bezpieczeństwa	Odczynnik	Bio-Rad	161-0301
Sacharoza	Odczynnik	Fluka	84097
P188	Odczynnik	Sigma-Aldrich	P 1300
mPEG 2000-DSPE	Odczynnik	Genzyme	LP-R4-039
Dotap	Odczynnik	Avanti Polar Lipid, Inc	890890 P
HEPES	Odczynnik	Sigma-Aldrich	83264
PLGA 75:25	Odczynnik	Sigma-Aldrich	P1941
Dichlorometan	Odczynnik	Acros Organics	75-09-2
Mannitol	Odczynnik	Sigma-Aldrich	M9546
CTAB	Odczynnik	Sigma-Aldrich	H 9151
Waga analityczna	Narzędzie	Denver Instrument
Mieszalnik T-18	Narzędzie	IKA
Ultrasonikator	Narzędzie	Cole-Parmer
Mielenie na mokro, MicroCer	Narzędzie	Netzsch Fine Particle Technology, LLC
Homogenizator, EmulsiFlex-C5	Narzędzie	Avestin, Inc.
Zetapotencjometr	Narzędzie	Malvern Instruments
System rozdzielczy gazów	Narzędzie	Victor Technologies
Badania in vitro
DMEM	Odczynnik	Mediatech, Inc.	10-013-CV
Gentamycyna	Odczynnik	Invitrogen	15710-064
Cyprofloksacyna	Odczynnik	Sigma-Aldrich	17850
Ludzki MCSF	Odczynnik	Miltenyi Biotec	130-093-964
Zbiór normalnej surowicy ludzkiej	Odczynnik	Cole-Parmer	WU-88061-68
płytki do hodowli tkankowej z 6 dołkami	Narzędzie	Corning	3524
metanol (klasa HPLC)	Odczynnik	Fisher Scientific	A452SK-4
probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,7 ml	Narzędzie	Krajowa Firma Naukowa	CN1700GT
Roztwór glutaraldehydu	Odczynnik	Sigma-Aldrich	49632
Roztwór czterotlenku osmu	Odczynnik	Sigma-Aldrich	75632
Wirówka 5417R	Narzędzie	Eppendorf	022621807
rotor z kątem stałym F-45-30-11	Narzędzie	Eppendorf	022636006
HIV-1ADA	Odczynnik
mysi przeciwciało monoklonalne przeciwko białku p24 HIV-1	Odczynnik	Dako	M0857
Szkiełka nakrywkowe do preparatów mikroskopowych	Narzędzie	Fisher Scientific	12-548-5P
Skróty użyte w tabeli: IDV: indynawir; RTV: rytonawir; ATV: atazanawir; EFV: efawirenz; PVA: poliwinyloalkohol; SDS: dodecylsiarczan sodu; P188: poloksamer 188 (nazywany również Pluronic F68); mPEG 2000-DSPE: metylo-poli(glikol etylenowy)1,2-distearoilowo-fosfatydyloetanoloamina; DOTAP: (1-oleoil-2-[6-[(7-nitro-2–1,3-benzoksadiazol-4-ylo) amino]heksanoylo]-3-trimetyloamoniowy propan); PLGA: kopolimer kwasu mlekowego i glikolowego; CTAB: bromek cetylotrimetyloamoniowy; DMEM: pożywka Dulbecco’s Modyfikowane Podłoże Eagle; MCSF: czynnik stymulujący wzrost kolonii makrofagów; HPLC: wysokosprawna chromatografia cieczowa; HIV-1: ludzki wirus niedoboru odporności typu 1