Opracowanie metod badania transportu nanoformułowanych leków antyretrowirusowych przez makrofagi w krwiobiegu

Podsumowanie

Nanocząsteczki indynawiru, rytonaviru, efawirenzu i atazanawiru zostały wytworzone przy użyciu mokrego mielenia, homogenizacji i sonikacji. Te nanoformulacje, określane wspólnie jako nanoformułowana terapia antyretrowirusowa (nanoART), posłużyły do oceny dostarczania leków za pomocą makrofagów. Określono stopień pobierania, retencji i przedłużonego uwalniania nanoART przez makrofagi pochodzące z monocytów. Te wstępne badania sugerują potencjał nanoART do zastosowań klinicznych.

Streszczenie

Leki w formie nanoformułacji mogą poprawić farmakodynamikę i biodostępność, służąc jednocześnie redukcji toksyczności leków w terapii antiretroviralnej (ART). W tym celu nasze laboratorium zastosowało zasady nanomedycyny w celu uproszczenia schematów leczenia ART, a tym samym zmniejszenia toksyczności przy jednoczesnej poprawie przestrzegania zaleceń terapeutycznych oraz farmakokinetyki leków. Przedstawiono proste i niezawodne metody wytwarzania nanoformułowanych leków ART (nanoART). Cząsteczki czystego leku są enkapsulowane w cienkiej warstwie powłoki lipidowej z surfaktantu i wytwarzane poprzez frakcjonowanie większych kryształów leku na mniejsze, wykorzystując mielenie na mokro lub homogenizację wysokociśnieniową. W alternatywnej metodzie wolny lek jest zawieszony w kropli polimeru. W tym przypadku lek rozpuszczany jest w polimerze, a następnie poddawany sonikacji do momentu utworzenia się pojedynczych kropli o rozmiarach nanometrycznych. Dynamiczne rozpraszanie światła oraz badanie mikroskopowe służą do charakterystyki właściwości fizycznych cząsteczek (rozmiaru cząstek, ładunku i kształtu). Ich właściwości biologiczne (wychwyt i retencja komórkowa, cytotoksyczność oraz skuteczność antiretroviralna) są określane z wykorzystaniem makrofagów pochodzących z ludzkich monocytów (MDM). MDM pochodzą z monocytów krwi obwodowej człowieka, izolowanych z leukopaków przy użyciu elutracji odśrodkowej w celu oczyszczenia. Takie makrofagi pochodzenia krwi mogą być wykorzystywane jako transportery komórkowe do dystrybucji nanoART do organów zainfekowanych wirusem niedoboru odpornościowego (HIV). Zakładamy, że ponowne sformułowanie dostępnych klinicznie leków antiretroviralnych w postaci nanocząsteczek do leczenia HIV-1 może poprawić przestrzeganie zaleceń terapeutycznych i pozytywnie wpłynąć na wyniki leczenia choroby.

Protokół

Produkcja NanoART

1. Mokre mielenie NanoART metodami NETZSCH MicroCer

1. Odważ kryształy leku oraz poszczególne surfaktanty, które zostaną wykorzystane do przygotowania nanoformulacji, używając wagi analitycznej, a następnie wymieszaj je z 10 mM buforem Hepes o pH 7.8 za pomocą mieszadła T-18 Ultraturrax do całkowitego rozproszenia. Procentowa zawartość leku w formulacji powinna wynosić od 1 do 2%.
2. W przypadku mielenia ciągłego upewnij się, że chłodziarka i kompresor są włączone. Przed rozpoczęciem mielenia próbki ciśnienie wylotowe powinno wynosić około 100 PSI.
3. Włącz jednostkę sterującą i obróć zbiornik mielący, aby umożliwić załadowanie mediów mielących do zbiornika.
4. Za pomocą lejka wsyp 50 mL kulek do komory mielącej. Upewnij się, że w gwintach lub w jakikolwiek miejscu poza komorą mielącą nie znajdują się kulki, aby uniknąć nieszczelności uszczelnienia mechanicznego.
5. Upewnij się, że pierścień O-ring znajduje się na swoim miejscu w komorze mielącej. Wybierz odpowiednią wielkość oczek sita i zastosuj odpowiedni zestaw pokrywy, a następnie zabezpiecz pokrywy, dokręcając nakrętki. Wielkość oczek sita powinna wynosić co najmniej połowę średnicy kulek. Użyj sita o większych oczkach, aby zapobiec zapychaniu filtra podczas mielenia ciągłego.
6. Za pomocą pokrętła znajdującego się na górze komory opuść komorę mielącą do pozycji poziomej i upewnij się, że wylotowa rura produktu odprowadza zawartość do naczynia zbierającego.
7. Wprowadź zawiesinę leku z różnymi ilościami surfaktantów do wlotu produktu. Minimalna objętość zawiesiny powinna wynosić 100 mL. Zapobiegnie to przegrzaniu komory mielącej oraz ograniczy zanieczyszczenie kulkami dzięki zmniejszeniu zużycia części.
8. Uruchom pompę za pomocą jednostki sterującej. Natężenie przepływu można dostosować zgodnie z wymaganiami dla danej formulacji (~ 50 - 150 mL/min).
9. Włącz mieszadło i dostosuj prędkość w jednostce sterującej. W urządzeniu MicroCer prędkość można zwiększyć z 620 rpm do 4320 rpm. Monitoruj temperaturę za pomocą manometru temperatury zamocowanego na górze komory mielącej i upewnij się, że nie dochodzi do przegrzania.
10. Miel próbkę przy różnych prędkościach i natężeniach przepływu, pobierając niewielkie alikwoty (~1 mL) formulacji do pomiarów wielkości i ładunku za pomocą Zetasizera Brookhaven (rozpraszanie światła dyfrakcyjnego) (Tabela 1).
11. Po uzyskaniu pożądanej wielkości cząstek zatrzymaj mielenie za pomocą jednostki sterującej. Przy wciąż włączonej pompie zbierz próbkę do kolby. Pozwól lekowi całkowicie spłynąć do kolby zbierającej próbki.
12. Wyłącz pompę. Aby usunąć kulki, umieść tackę zbierającą pod urządzeniem. Poluzuj nakrętki na przedniej płycie zestawu pokrywy i zbierz kulki do tacki. Zdejmij przednią płytę i użyj butelki z wodą dejonizowaną, aby wypłukać kulki do tacki.
13. Przenieś zmieloną zawiesinę do 50 mL probówek wirówkowych i ustaw wirówkę na 10 000 rpm (10 174 rcf) na 30 minut. Po zakończeniu cyklu wirowania zmierz objętość supernatantu i zastąp ją taką samą ilością świeżego roztworu surfaktantu.
14. Po zakończeniu resuspensji przenieś zawiesinę do komory mielącej i miel przez 10 minut. Pobierz alikwot (~ 1 mL) i ponownie zmierz wielkość oraz ładunek próbki za pomocą Zetasizera (Tabela 1).
15. Przeprowadź czyszczenie urządzenia MicroCer po użyciu, stosując wodę dejonizowaną i 70% etanol.
16. Zmierz stężenie formulacji nanoART za pomocą HPLC. W naszym przypadku próbki oceniano metodą HPLC w fazie odwróconej, wykonując potrójne wstrzyknięcia 20 μL na kolumnę YMC Octyl C8 (Waters Inc., Milford, MA) z wkładem ochronnym C8. Fazę ruchomą składającą się z 48% acetonitrylu / 52% 25mM KH₂PO₄, pH 4.15, pompowano z przepływem 0.4 mL/min z detekcją UV/Vis przy 272 nm. Dla wszystkich pomiarów leku ilościowe oznaczenie ustalano poprzez porównanie z krzywą wzorcową każdego wolnego leku (0.025-100 μg/ mL) przygotowaną w metanolu.

2. Homogenizacja NanoART przy użyciu Avestin EmulsiFlex C5

1. Odważyć kryształy leku oraz poszczególne surfaktanty, które zostaną wykorzystane do przygotowania nanoformulacji, używając wagi analitycznej, a następnie zmieszać je z buforem Hepes 10 mM, pH 7.8 za pomocą miksera T-18 Ultraturrax w celu uzyskania pełnej dyspersji.
2. Przenieść zawiesinę do naczynia homogenizującego i rozpocząć recyrkulację. Przed rozpoczęciem homogenizacji próbki upewnić się, że chłodziarka jest włączona
3. Stopniowo zwiększać ciśnienie, aż miernik wskaże wartość 20,000 ± 2,000 psi, i kontynuować homogenizację do momentu osiągnięcia docelowego rozmiaru cząstek. Zazwyczaj trwa to od 45 do 60 minut. Okresowo pobierać alikwot (~ 1mL) i mierzyć rozmiar oraz ładunek próbki za pomocą Zetasizera (Tabela 1).
4. Przenieść zhomogenizowaną zawiesinę z homogenizatora do probówek wirówkowych o pojemności 50 mL i ustawić wirówkę na 10,000 rpm (10,174 rcf) na 30 minut. Po zakończeniu cyklu wirowania zmierzyć objętość supernatantu i zastąpić ją równą objętością świeżego roztworu surfaktantu.
5. Po resuspensji przenieść zawiesinę do homogenizatora C5. Ponownie uruchomić cyrkulację, przywrócić ciśnienie homogenizacji do 20,000 ± 2,000 psi i homogenizować przez 30 minut. Zmierzyć rozmiar i ładunek formulacji za pomocą Zetasizera (Tabela 1).
6. Przeprowadzić czyszczenie urządzenia po pracy, używając wody dejonizowanej i etanolu jako rozpuszczalnika.
7. Zmierzyć stężenie próbek za pomocą HPLC.

3. Sonikacja z użyciem procesora ultradźwiękowego Cole Parmer

1. Odmierz 50 mL dichlorometanu do zlewki szklanej. Odważ 6 g poli(laktydo-ko-glikolidu) (PLGA) za pomocą wagi analitycznej, dodaj do dichlorometanu i mieszaj do całkowitego rozpuszczenia.
2. Odważ 1,25 g kryształów leku i dodaj do roztworu dichlorometanu/PLGA. Mieszaj do całkowitego rozpuszczenia.
3. Przygotuj 1% roztwór surfaktantu z alkoholu poliwinylowego (PVA) i schłodź go w łaźni lodowej. Upewnij się, że roztwór surfaktantu jest schłodzony przed dodaniem roztworu organicznego zawierającego rozpuszczony lek.
4. Wlej roztwór leku do 1% roztworu surfaktantu PVA i uruchom sonikator w amplitudzie 50%. Upewnij się, że roztwór surfaktantu znajduje się w łaźni lodowej. W przypadku mniejszych partii próbek amplitudę sonikatora można zmniejszyć do ~ 30%. Sonikuj próbkę przez 10 minut.
5. Pobierz małą alikwot (~ 1 mL) do analizy wielkości cząstek (Tabela 1). Jeśli wielkość cząstek przekracza 1,5 μm, sonikuj próbkę w odstępach 2-minutowych do maksymalnie 16 minut łącznie. Obserwuj próbki pod mikroskopem przy powiększeniu 20x i udokumentuj obserwacje (Rycina 1A).
6. Użyj mieszadła magnetycznego, aby stworzyć odpowiedni wir dla pozostałej zawiesiny, i kontynuuj mieszanie przez noc w temperaturze pokojowej.
7. Odważ 8 g mannitolu do kolby i dodaj 80 mL wody RO. Mieszaj do całkowitego rozpuszczenia i przechowuj w temperaturze pokojowej. Roztwór ten zostanie użyty do resuspensji po wirowaniu, jeśli próbki będą wymagały liofilizacji.
8. Zabierz zawiesinę po 24 godzinach i przelej do probówek wirówkowych o pojemności 50 mL. Wirować próbki z prędkością 8 000 rpm przez 20 minut w temperaturze 5°C. Odlej nadsącz i resuspenduj jedną połowę próbki w 75 mL filtrowanej wody z odwróconej osmozy (RO), a drugą połowę w 75 mL 0,5% surfaktantu bromku cetylotrimetyloamoniowego (CTAB).
9. Ponownie odwiruj próbki z prędkością 8 000 rpm przez 20 minut w temperaturze 5°C i resuspenduj każdy z osadów w łącznie 20 mL roztworu mannitolu.
10. Po drugiej resuspensji zmierz wielkość cząstek za pomocą Zetasizera (Tabela 1).
11. Przenieś pozostałą zawiesinę do odpowiednich fiolek i umieść je w liofilizatorze.
12. Zmierz stężenie próbek za pomocą HPLC.

4. Morfologia NanoART

1. Należy pobrać zawiesinę nanoART i krótko poddać ją sonikacji za pomocą sondy sonikacyjnej przy amplitudzie 20% przez 5 sekund. Przenieść 10 μL zawiesiny do 1,5 mL wody RO w probówce do mikrocentryfugi o pojemności 1,7 mL, a następnie mieszać w wirówce vortex przez 10 sekund.
2. Pobrać próbkę 50 μL wodnego roztworu nanoART i przenieść ją do aparatu filtracyjnego składającego się z polipropylenowego uchwytu filtra Swinnex 13 z zamontowaną membraną filtracyjną z poliwęglanu o rozmiarze porów 0,2 μm (Nuclepore Track-Etched). Przed dodaniem rozcieńczonej zawiesiny leku aparat filtracyjny należy nasycić 50 μL wody destylowanej przefiltrowanej przez filtr 0,2 μm. Następnie do aparatu przyłożyć próżnię, aż cała objętość roztworu zostanie całkowicie przepuszczona przez membranę filtracyjną.
3. Po wyschnięciu membranę przytwierdzamy do aluminiowego trzpienia podkładki za pomocą dwustronnej przewodzącej taśmy węglowej i napylamy warstwę palladu. Następnie próbkę obrazujemy, w naszym przypadku przy użyciu niskonapiowego skaningowego mikroskopu elektronowego z emisją polową JEOL JSM6300F (Rysunek 2).

5. Wizualizacja NanoART

1. Przygotowane zawiesiny nanoART poddać sonikacji przez 10 sekund przy amplitudzie 20% za pomocą sondy sonikacyjnej.
2. Wziąć szkiełko nakrywkowe i umieścić je na mikroskopie odwróconym. Na nakrywce wymieszać 15 μL zawiesiny nanoART ze 100 μL soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS), mieszając poprzez kilkukrotne pipetowanie. Nanocząsteczki zwizualizować przy użyciu obiektywu 20x (Rycina 3).

Biologia nanoART

6. Izolacja i przygotowanie monocytów z krwi oraz makrofagów pochodzących z monocytów (MDM)

1. Pozyskać ludzkie monocyty drogą leukaferezy od dawców seronegatywnych w kierunku HIV-1 i zapalenia wątroby, a następnie oczyścić komórki za pomocą przeciwprądowej elutracji odśrodkowej. Czystość komórek ocenić poprzez immunoznakowanie przeciwciałem anty-CD68 (klon KP-1) w preparatach cytospin barwionych metodą Wrighta 1.
2. Kulturować oczyszczone monocyty w medium DMEM uzupełnionym o 10% inaktywowanej termicznie puli ludzkiej surowicy, 1% glutaminy, 50 μg/ mL gentamycyny, 10 μg/ mL cyprofloksacyny oraz 1000 U/ mL rekombinowanego ludzkiego czynnika stymulującego kolonie makrofagów (MCSF) w stężeniu 1x10⁶ komórek/ mL w temperaturze 37°C w atmosferze uwilgotnionej z 5% CO₂. Wysiać 2x10⁶ komórek na dołek w płytkach 6-dołkowych i inkubować przez 7 dni, aby umożliwić różnicowanie się monocytów w makrofagi 1. (Ryc. 3A)

7. Pobieranie i zbieranie komórek

1. Wymieszać nanoART z pożywką hodowlaną (bez MCSF) do stężenia końcowego 100 μM i dodać 1 mL pożywki z lekiem do każdego dołka.
2. W wyznaczonym punkcie czasowym lub po całkowitym załadowaniu komórek nanoART (Ryc. 2), usunąć całą pożywkę i wypłukać komórki 3 razy 1 mL PBS, aby usunąć cząsteczki, które nie zostały pochłonięte przez komórki. Za pomocą scrapera do komórek zebrać komórki przylegające z dna dołka w 1 mL PBS i przenieść je do probówki do mikrowirówki o pojemności 1,7 mL 2-4.
3. Wirować komórki z prędkością 1,000 rcf w temperaturze 4°C przez 10 minut. Usunąć nadsącz i dodać 200 μL 100% metanolu. Zlizować komórki i rozpuścić nanoART poprzez krótką (2-5 sekund) sonikację osadu za pomocą sondy sonikacyjnej przy amplitudzie 20%. Próbki przechowywać w temperaturze -80°C do momentu analizy zawartości leku.

8. Wewnątrzkomórkowa retencja NanoART

1. Poddać MDM działaniu preparatów zgodnie z opisem w punkcie 7.1.
2. W wyznaczonym punkcie czasowym przemyć komórki zgodnie z opisem w punkcie 7.2; jednak zamiast natychmiastowego zeskrobania komórek, utrwalić je przez 15 min w temperaturze pokojowej w roztworze 3% glutaraldehydu w 0,1 M buforze fosforanowym (pH 7,4), a następnie utrwalić przez kolejne 10 minut za pomocą 1% czterotlenku osmu w 0,1 M buforze fosforanowym (pH 7,4).
3. Usunąć utrwalacz i zeskrobać komórki w 1 mL PBS zgodnie z opisem w punkcie 7.2. Następnie zebrać i odwirować komórki zgodnie z opisem w punkcie 7.2; jednak zamiast dodawania metanolu do osadu, dodać 200 μL roztworu utrwalającego z glutaraldehydem.
4. Przygotować z osadu komórkowego cienkie (80 nm) skrawki za pomocą mikrotomu. Skrawki zabarwić octanem uranylu i cytrynianem ołowiu. Obserwować zabarwione skrawki przy użyciu transmisyjnego mikroskopu elektronowego (Rycina 4).

9. Uwalnianie ART

1. Poddać komórki działaniu czynników zgodnie z opisem w punktach 7.1-7.2; jednak zamiast zbierać komórki po przemyciu, zastąpić PBS 2 mL pożywki do hodowli komórkowej bez dodatku MCSF i nanoART.
2. W wyznaczonych dniach lub w przypadku zażółcenia pożywki do hodowli komórkowej, wymienić połowę pożywki.
3. W wybranym dniu pobrać 1 mL pożywki komórkowej wraz z powtórzonymi próbkami komórek zgodnie z opisem w punktach 7.2-7.3.
4. Przetworzyć komórki zgodnie z opisem w punkcie 7.3. Przetworzyć pożywkę, dodając 150 μL próbki pożywki do 1 mL 100% metanolu, a następnie mieszać na vortexie z maksymalną prędkością przez 10 sekund. Następnie odwirować próbki przy 21,000 rcf przez 10 minut. Zebrać nadsącz i przenieść go do nowej probówki. Odparować metanol w wirówce próżniowej; proces ten może trwać od 1 do 4 godzin, w zależności od próbki. Próbki przechowywać w temperaturze -80°C do momentu przeprowadzenia analizy leków.

10. Obserwacja poboru NanoART w czasie rzeczywistym przy użyciu mikroskopii konfokalnej

1. Pobrać dojrzałe MDM z etapu 6.2 i oznakować komórki za pomocą roztworu do znakowania komórek, takiego jak Vybrant Cell Labeling Solution, zgodnie z instrukcją producenta. Przepłukać komórki 3 razy, używając 1 mL pożywki hodowlanej, aby usunąć nadmiar barwnika.
2. Wymieszać nanoART z pożywką hodowlaną, analogicznie jak w etapie 7.1, stosując nanoART znakowany fluorescencyjnie.
3. Dodać pożywkę z nanonanoszącym nanoART bezpośrednio przed obrazowaniem za pomocą mikroskopu konfokalnego. Wykonywać zdjęcia co 30 sekund przez 4 godziny, używając obiektywu 60x (Filmy 1 i 2).

Testy zakażenia i zakaźności HIV-1

11. Zakażenie HIV-1_ADA

1. Komórki należy traktować zgodnie z opisem w punktach 9.1-9.3.
2. W wybranych dniach należy usunąć całą pożywkę i zastąpić ją pożywką bez MCSF, zawierającą HIV-1_ADA z wielokrotnością infekcji wynoszącą 0,01 cząstek wirusa/komórkę, a następnie inkubować przez 24 godziny 1. Po tym czasie należy usunąć pożywkę z wirusem i zastąpić ją świeżą pożywką wolną od wirusa. Komórki należy hodować przez 10 dni, wymieniając połowę pożywki co drugi dzień lub w razie potrzeby, aby utrzymać żywotność komórek (Rysunek 5) 6.
3. Dziesięć dni po infekcji należy pobrać 10 μL pożywki z każdej studni, przenieść do płytki 96-dołkowej i przechowywać w temperaturze -80°C do czasu przeprowadzenia analizy odwrotnej transkryptazy retrowirusowej.

12. Analiza aktywności odwrotnej transkryptazy (RT)

1. Do każdej 10 μL próbki z kroku 11.3 dodać 10 μL roztworu zawierającego 100 mM Tris-HCl (pH 7.9), 300 mM KCl, 10 mM DTT, 0,1% nonyl fenoksylowo-polietoksyloetanolu-40 (NP-40) oraz wodę. Mieszaninę inkubować przez 15 minut w temperaturze 37°C 7.
2. Następnie do każdego dołka dodać 25 μL roztworu zawierającego 50 mM Tris-HCl (pH 7.9), 150 mM KCl, 5 mM DTT, 15 mM MgCl₂, 0,05% NP-40, 10 μg/ mL poly (A), 0,250 U/ mL oligo d(T)_12-18 oraz 10 μCi/ mL ³H-TTP i inkubować w temperaturze 37°C przez 18 godzin 7.
3. Po inkubacji do każdego dołka dodać 50 μL lodowatego 10% kwasu trójchlorooctowego (TCA). Próbki z dołków przenieść na filtry z włókna szklanego, a następnie ocenić inkorporację ³H-TTP na filtrach za pomocą spektroskopii β-scyntylacyjnej 7.

13. Wykrywanie HIV-1p24

1. Komórki powtórzone, z których w kroku 11.3 pobrano próbkę medium do analizy odwrotnej transkryptazy retrowirusowej, przemyć 3 razy 1 mL PBS.
2. Utrwalić komórki w 4% paraformaldehydzie przez noc w temperaturze 4°C. Następnego dnia rano przemyć komórki 3 razy PBS.
3. Aby zwizualizować infekcję HIV, zastosować mysie przeciwciała monoklonalne przeciwko HIV-1 p24 (1:10, Dako, Carpinteria, CA). Wykonać obrazowanie komórek w polu jasnym przy użyciu obiektywu 40x (Rysunek 6).

14. Reprezentatywne wyniki:

Lek	Rozmiar (nm)	PDI	Ładunek (mv)	Surfaktanty
IDV	1052	0.286	-24.58	0.5% P188, 5.0% SDS, 9.25% sacharozy
RTV	233	0.273	-7.47	0.5% P188, 9.25% sacharozy
ATZ	840	0.192	+25.47	0.5% P188, 0.1% mPEG 2000-DSPE, 1.0% DOTAP, 9.25% sacharozy
EFV	347	0.235	-13.52	1.0 % PVA

Tabela 1. Charakterystyka fizyczna nanoART
Tabela przedstawia potencjalne wartości reprezentatywne dla charakterystyki fizycznej formulacji nanoART wytworzonych przy użyciu wskazanych surfaktantów. Wartości obejmują średnicę średnią opartą na intensywności rozproszonego światła, indeks polidyspersyjności (PDI, szacunek rozkładu wielkości cząstek) oraz wartości potencjału zeta uzyskane dla różnych próbek nanoformulacji. Skróty użyte w tabeli: IDV: indynawir; RTV: rytonawir; ATV: atazanawir; EFV: efawirenz; PVA: alkohol poliwinylowy; SDS: dodecylosiarczan sodu; P188: poloksamer 188 (nazywany również Pluronic F68); mPEG 2000-DSPE: metylo-poli(glikol etylenowy)1,2-distearoilowo-fosfatydyloetanoloamina; DOTAP: (1-oleoil-2-[6-[(7-nitro-2-1,3-benzooksadiazol-4-yl) amino]heksanoylo]-3-trimetyloamoniowy propan.

RYSUNEK 1. Schemat blokowy podsumowujący różne metody stosowane do wytwarzania nanoART.
Rysunek 1 przedstawia podsumowanie różnych metod stosowanych do wytwarzania nanoART. Schemat blokowy zawiera przewidywany czas przeznaczony na każdą z krytycznych faz poszczególnych metod.

RYSUNEK 2. Reprezentatywne obrazy pożądanej i niepożądanej morfologii NanoART. Analiza za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej (powiększenie 15 000X) RTV nanoART otrzymanego poprzez homogenizację, mielenie na mokro i sonikację na membranie filtracyjnej z poliwęglanu o rozmiarze porów 0.2 μm. Pasek skali wynosi 2.0 μm we wszystkich kadrach. Pożądane nanoART składają się średnio z małych (≤ 2 μm) odrębnych cząstek o gładkich krawędziach, które mają tendencję do przybierania takiego samego lub podobnego kształtu. Niepożądane nanoART wykazują dużą zmienność zarówno pod względem wielkości, jak i kształtu oraz mogą się ze sobą zlewać i/lub sklejać.

RYCINA 3. Obrazy prawidłowego roztworu nanoART oraz MDM pobierających nanoART. Obrazy z mikroskopii w polu jasnym (wszystkie wykonane przy użyciu obiektywu 20x) homogenizowanych RTV-NP oraz MDM pobierających nanoART. Po połączeniu 10 μL roztworu RTV-NP z 100 μL PBS na szkiełku podstawowym cząsteczki są widoczne i przypominają piasek, przy czym tylko kilka większych cząsteczek można zidentyfikować indywidualnie (A). Obraz w pełni zróżnicowanych i wrzecionowatych MDM przed traktowaniem nanoART (B). Po pobraniu nanoART przez komórki stają się one ciemniejsze, a ich jądra stają się bardziej wyraźne ze względu na okołojądrową dystrybucję nanoART; zachowują one jednak wrzecionowaty kształt ciała komórki (C). Gdy komórki zostaną przeładowane nanoART, jądra stają się niewidoczne, a komórki przyjmują kształt kulisty, tracąc strukturę wrzecionowatą i potencjalnie odrywając się od dna dołka (D).

RYSUNEK 4. Potwierdzenie wbudowania nanoART do wnętrza MDM. Transmisyjna mikroskopia elektronowa (powiększenie 15 000x) wykazuje pobieranie nanoART przez MDM poddane działaniu RTV-NP otrzymanych poprzez homogenizację (A), RTV-NP otrzymanych poprzez mielenie na mokro (B), RTV-NP otrzymanych poprzez sonikację (C) oraz komórki nieleczone (D). Wewnątrz komórek nanoART powinny być łatwo identyfikowalne dzięki swojemu geometrycznemu kształtowi. Należy zwrócić uwagę na brak wyraźnych struktur geometrycznych w komórce kontrolnej (D). Przykładowe cząstki zostały obrysowane: na czerwono dla homogenizacji (A), na niebiesko dla mielenia na mokro (B), na zielono dla sonikacji (C). Struktura cząstek powinna odpowiadać strukturze zaobserwowanej przy użyciu SEM. Pasek skali wynosi 5,0 μm we wszystkich kadrach.

RYCINA 5. Schemat metody badania skuteczności przeciwwirusowej nanoART. Aby przetestować zdolność nanoART do hamowania replikacji wirusa, MDM muszą zostać najpierw poddane działaniu nanoART, a następnie wystawione na działanie HIV-1_ADA. Podobnie jak w badaniach uwalniania ART, MDM są obciążane nanoART, a następnie płukane w celu usunięcia cząsteczek, które nie zostały zinternalizowane. Obciążone nanoART komórki MDM są następnie hodowane do 15 dni z wymianą połowy pożywki co drugi dzień. W tym czasie (zazwyczaj w dniach 1, 5, 10 i 15) MDM są poddawane infekcji HIV-1_ADA. Po każdej ekspozycji na wirusa komórki są hodowane przez kolejne 10 dni, aby umożliwić postęp infekcji. W 10. dniu po infekcji pobiera się próbki pożywki do analizy RT, a komórki są utrwalane i barwione pod kątem obecności antygenu p24. Równolegle hodowane są również MDM niepoddane działaniu nanoART, zarówno zainfekowane, jak i niezainfekowane, które są badane pod kątem obecności antygenu p24 oraz aktywności RT.

RYCINA 6. Badanie skuteczności nanoART w zainfekowanych HIV-1 MDM za pomocą barwienia p24. Obrazy w polu jasnym (obiektyw 20x) MDM traktowanych RTV-NP 10 dni po ekspozycji na HIV-1_ADA. Nie stwierdzono infekcji, gdy komórki zostały poddane działaniu wirusa 1 dzień po zastosowaniu nanoART (A); zwróć uwagę na obecność NP w cytoplazmie większości komórek (powiększenie w A wskazane strzałkami). Infekcja wystąpiła, gdy komórki zostały wystawione na działanie wirusa 10 dni po zastosowaniu nanoART (B), choć w znacznie mniejszym stopniu niż w komórkach nietraktowanych nanoART (D); zwróć uwagę na utrzymującą się obecność NP w niektórych komórkach (powiększenie w B wskazane strzałkami), lecz w mniejszej liczbie niż w 1. dniu po zastosowaniu nanoART (powiększenie w A). Obraz komórek, które nie były traktowane nanoART ani zainfekowane (C); zwróć uwagę na brak NP w cytoplazmie komórek (powiększenie w C). Obraz komórek, które nie były traktowane nanoART, lecz wystawione na działanie HIV-1_ADA (D).

WIDEO 1. Konfokalna mikroskopia żywych komórek ukazująca słabe pobieranie RTV-NP przez MDM. Mikroskopia fluorescencyjna MDM znakowanych na zielono roztworem do znakowania komórek Vybrant DiO i traktowanych znakowanymi na czerwono RTV-NP. Obraz pobierano co 30 sekund przez 4 h przy powiększeniu 60x. Kliknij tutaj, aby obejrzeć wideo

WIDEO 2. Konfokalna mikroskopia żywych komórek obrazująca pomyślne pobieranie RTV-NP przez MDM. Mikroskopia fluorescencyjna MDM oznakowanych na zielono za pomocą roztworu do znakowania komórek Vybrant DiO i traktowanych czerwonymi RTV-NP. Obraz był rejestrowany co 30 sekund przez 4 godziny przy powiększeniu 60x. Kliknij tutaj, aby obejrzeć wideo

Dyskusja

NanoART zostały zaprojektowane w celu usprawnienia terapii HIV-1. Zaproponowaliśmy system dostarczania leków oparty na monocytach i makrofagach jako pierwszy krok w stronę opracowania takich technologii do zastosowań klinicznych oraz jako laboratoryjny system testowy do rozwoju leków w formie nanoformułacji. Nasze wcześniejsze prace wykazały, że system ten nadaje się do takiego zastosowania^5,6.

W niniejszym opracowaniu przedstawiono metody syntezy NP powszechnie stosowanych leków przeciwko HIV-1 (indynawiru, IDV; rytonawiru, RTV; efawiirenzu, EFV oraz atazanawiru, ATV). Osiągnięto to poprzez mielenie na mokro, homogenizację i sonikację. Co istotne, nasze podejście pozwala na modyfikację charakterystyk fizycznych nanoART, takich jak rozmiar, kształt i ładunek ^5,6. Poprzez staranny dobór surfaktantów można kontrolować ładunek cząsteczki w zakresie od silnie ujemnego, przez neutralny, aż po silnie dodatni. Poprzez zmianę czasu i intensywności procesu można kontrolować rozmiar, uzyskując cząsteczki o wielkości od ≤ 200 nm do ≥ 3 μm. Kształt cząsteczki również można kontrolować, choć w mniejszym stopniu niż pozostałe charakterystyki fizyczne. Na przykład cząsteczki sferyczne można wytworzyć poprzez sonikację z polimerami, natomiast wieloboczne kształty geometryczne można uzyskać za pomocą mielenia na mokro lub homogenizacji. Mielenie na mokro i homogenizacja dają cząsteczki o różnych kształtach, jednak proces ten zależy od metody frakcjonowania i nie może być bezpośrednio kontrolowany. Właściwości tych metod wytwarzania mogą umożliwić badaczom łatwe otrzymywanie nanoART zgodnie z dokładnymi specyfikacjami projektowymi. Jest to niezwykle ważne, ponieważ właściwości fizykochemiczne nanoART mają silny wpływ zarówno na ich stabilność, jak i na sposób oddziaływania z komórkami. Wykazaliśmy na przykład, że nanoART o rozmiarze około 1 μm, silnym ładunku dodatnim i wielobocznym kształcie geometrycznym są szybciej pobierane przez makrofagi, są bardziej stabilne po dostaniu się do wnętrza komórek i uwalniane w dłuższym okresie czasu 6.

Opracowano metodę testowania nanoART, która umożliwia proste badanie zdolności cząsteczek do być pobieranych, zatrzymywanych i uwalnianych przez makrofagi — jedne z głównych komórek docelowych HIV-1 — a także ich zdolności do hamowania replikacji wirusa. Pozwala to na łatwe różnicowanie nanoART na podstawie ich wydajności i zidentyfikowanie tych, które mają największą szansę na sukces w modelu in vivo, co zwiększa zarówno efektywność, jak i szybkość opracowywania nanoART do zastosowań u ludzi.

Wykazano, że makrofagi z szpiku kostnego myszy, załadowane ex vivo preparatem nanoART i przeniesione adoptywnie poprzez wtryskiwanie dożylne do myszy zhumanizowanych zainfekowanych HIV-1, mogą przemieszczać się do miejsc aktywnej infekcji, w tym do ośrodkowego układu nerwowego, i uwalniać leki przez okres do 2 tygodni w celu zahamowania replikacji wirusa^2-4. Ponadto komórki załadowane nanoART były w stanie skutecznie zredukować liczbę zainfekowanych wirusem komórek w osoczu, węzłach chłonnych, śledzionie, wątrobie i płucach, a także chronić komórki CD4+². Badania te, choć wstępne, dowodzą, że komórkowy system dostarczania nanoART może rozprowadzić klinicznie istotne ilości leku zarówno do krwi, jak i do zainfekowanych tkanek. Ze względu na obiecujące wstępne wyniki badań na myszach zainfekowanych HIV-1, obecnie opracowujemy model makaków zainfekowanych wirusem niedoboru odporności u naczelnych, aby dalej testować potencjał nanoART do zastosowań klinicznych.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Produkcja nanoART
Siarczan indynawiru	Odczynnik	Longshem Co., Szanghaj, Chiny	CAS nr 157810-81-6
Rytonawir	Odczynnik	China Shengda Pharmaceutical Company, Chiny	Nr CAS 155213-67-5
Siarczan atazanawiru	Odczynnik	Gyma Laboratories of America INC	Nr CAS 198904-31-3
Efavirenz	Odczynnik	Hetero Labs LTD, Indie	Nr CAS 154598-52-4
PVA	Odczynnik	Sigma-Aldrich	P 8136
Karta charakterystyki bezpieczeństwa	Odczynnik	Bio-Rad	161-0301
Sacharoza	Odczynnik	Fluka	84097
P188	Odczynnik	Sigma-Aldrich	P 1300
mPEG 2000-DSPE	Odczynnik	Genzyme	LP-R4-039
Dotap	Odczynnik	Avanti Polar Lipid, Inc	890890 P
HEPES	Odczynnik	Sigma-Aldrich	83264
PLGA 75:25	Odczynnik	Sigma-Aldrich	P1941
Dichlorometan	Odczynnik	Acros Organics	75-09-2
Mannitol	Odczynnik	Sigma-Aldrich	M9546
CTAB	Odczynnik	Sigma-Aldrich	H 9151
Waga analityczna	Narzędzie	Denver Instrument
Mieszalnik T-18	Narzędzie	IKA
Ultrasonikator	Narzędzie	Cole-Parmer
Mielenie na mokro, MicroCer	Narzędzie	Netzsch Fine Particle Technology, LLC
Homogenizator, EmulsiFlex-C5	Narzędzie	Avestin, Inc.
Zetapotencjometr	Narzędzie	Malvern Instruments
System rozdzielczy gazów	Narzędzie	Victor Technologies
Badania in vitro
DMEM	Odczynnik	Mediatech, Inc.	10-013-CV
Gentamycyna	Odczynnik	Invitrogen	15710-064
Cyprofloksacyna	Odczynnik	Sigma-Aldrich	17850
Ludzki MCSF	Odczynnik	Miltenyi Biotec	130-093-964
Zbiór normalnej surowicy ludzkiej	Odczynnik	Cole-Parmer	WU-88061-68
płytki do hodowli tkankowej z 6 dołkami	Narzędzie	Corning	3524
metanol (klasa HPLC)	Odczynnik	Fisher Scientific	A452SK-4
probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,7 ml	Narzędzie	Krajowa Firma Naukowa	CN1700GT
Roztwór glutaraldehydu	Odczynnik	Sigma-Aldrich	49632
Roztwór czterotlenku osmu	Odczynnik	Sigma-Aldrich	75632
Wirówka 5417R	Narzędzie	Eppendorf	022621807
rotor z kątem stałym F-45-30-11	Narzędzie	Eppendorf	022636006
HIV-1ADA	Odczynnik
mysi przeciwciało monoklonalne przeciwko białku p24 HIV-1	Odczynnik	Dako	M0857
Szkiełka nakrywkowe do preparatów mikroskopowych	Narzędzie	Fisher Scientific	12-548-5P
Skróty użyte w tabeli: IDV: indynawir; RTV: rytonawir; ATV: atazanawir; EFV: efawirenz; PVA: poliwinyloalkohol; SDS: dodecylsiarczan sodu; P188: poloksamer 188 (nazywany również Pluronic F68); mPEG 2000-DSPE: metylo-poli(glikol etylenowy)1,2-distearoilowo-fosfatydyloetanoloamina; DOTAP: (1-oleoil-2-[6-[(7-nitro-2–1,3-benzoksadiazol-4-ylo) amino]heksanoylo]-3-trimetyloamoniowy propan); PLGA: kopolimer kwasu mlekowego i glikolowego; CTAB: bromek cetylotrimetyloamoniowy; DMEM: pożywka Dulbecco’s Modyfikowane Podłoże Eagle; MCSF: czynnik stymulujący wzrost kolonii makrofagów; HPLC: wysokosprawna chromatografia cieczowa; HIV-1: ludzki wirus niedoboru odporności typu 1