Opracowanie metod badania transportu nanoformułowanych leków antyretrowirusowych przez makrofagi w krwiobiegu

Podsumowanie

Nanocząsteczki indynawiru, rytonaviru, efawirenzu i atazanawiru zostały wytworzone przy użyciu mokrego mielenia, homogenizacji i sonikacji. Te nanoformulacje, określane wspólnie jako nanoformułowana terapia antyretrowirusowa (nanoART), posłużyły do oceny dostarczania leków za pomocą makrofagów. Określono stopień pobierania, retencji i przedłużonego uwalniania nanoART przez makrofagi pochodzące z monocytów. Te wstępne badania sugerują potencjał nanoART do zastosowań klinicznych.

Streszczenie

Leki w formie nanoformułacji mogą poprawić farmakodynamikę i biodostępność, służąc jednocześnie redukcji toksyczności leków w terapii antiretroviralnej (ART). W tym celu nasze laboratorium zastosowało zasady nanomedycyny w celu uproszczenia schematów leczenia ART, a tym samym zmniejszenia toksyczności przy jednoczesnej poprawie przestrzegania zaleceń terapeutycznych oraz farmakokinetyki leków. Przedstawiono proste i niezawodne metody wytwarzania nanoformułowanych leków ART (nanoART). Cząsteczki czystego leku są enkapsulowane w cienkiej warstwie powłoki lipidowej z surfaktantu i wytwarzane poprzez frakcjonowanie większych kryształów leku na mniejsze, wykorzystując mielenie na mokro lub homogenizację wysokociśnieniową. W alternatywnej metodzie wolny lek jest zawieszony w kropli polimeru. W tym przypadku lek rozpuszczany jest w polimerze, a następnie poddawany sonikacji do momentu utworzenia się pojedynczych kropli o rozmiarach nanometrycznych. Dynamiczne rozpraszanie światła oraz badanie mikroskopowe służą do charakterystyki właściwości fizycznych cząsteczek (rozmiaru cząstek, ładunku i kształtu). Ich właściwości biologiczne (wychwyt i retencja komórkowa, cytotoksyczność oraz skuteczność antiretroviralna) są określane z wykorzystaniem makrofagów pochodzących z ludzkich monocytów (MDM). MDM pochodzą z monocytów krwi obwodowej człowieka, izolowanych z leukopaków przy użyciu elutracji odśrodkowej w celu oczyszczenia. Takie makrofagi pochodzenia krwi mogą być wykorzystywane jako transportery komórkowe do dystrybucji nanoART do organów zainfekowanych wirusem niedoboru odpornościowego (HIV). Zakładamy, że ponowne sformułowanie dostępnych klinicznie leków antiretroviralnych w postaci nanocząsteczek do leczenia HIV-1 może poprawić przestrzeganie zaleceń terapeutycznych i pozytywnie wpłynąć na wyniki leczenia choroby.

Protokół

Produkcja NanoART

1. Metody mokrego mielenia NanoART firmy NETZSCH MicroCer

1. Odważ kryształy leku oraz poszczególne surfaktanty, które zostaną wykorzystane do przygotowania nanoformulacji, używając wagi analitycznej, a następnie zmieszaj je z 10 mM buforem Hepes o pH 7.8 za pomocą miksera T-18 Ultraturrax aż do całkowitego rozproszenia. Procentowa zawartość leku w formulacji powinna wynosić od 1 do 2%.
2. W przypadku mielenia ciągłego upewnij się, że chłodziarka i kompresor są włączone. Przed rozpoczęciem mielenia próbki ciśnienie wylotowe powinno wynosić około 100 PSI.
3. Włącz jednostkę sterującą i obróć zbiornik mielący, aby umożliwić załadowanie mediów mielących do zbiornika.
4. Za pomocą lejka wsyp 50 mL kulek do komory mielącej. Upewnij się, że w gwintach lub w jakimkolwiek miejscu poza komorą mielącą nie znajdują się kulki, aby uniknąć nieszczelności uszczelnienia mechanicznego.
5. Upewnij się, że oring znajduje się na swoim miejscu w komorze mielącej. Wybierz odpowiednią wielkość oczek sita, zastosuj właściwy zestaw pokrywy i zabezpiecz pokrywy, dokręcając nakrętki. Wielkość oczek sita powinna stanowić co najmniej połowę rozmiaru kulek. Użyj sita o dużych oczkach, aby zapobiec zapychaniu filtra podczas mielenia ciągłego.
6. Za pomocą pokrętła znajdującego się na górze komory opuść komorę mielącą do pozycji poziomej i upewnij się, że wylotowa rurka produktu odprowadza zawiesinę do naczynia zbierającego.
7. Wprowadź zawiesinę leku z różnymi ilościami surfaktantów do wlotu produktu. Minimalna objętość zawiesiny powinna wynosić 100 mL. Zapobiegnie to przegrzaniu komory mielącej, a także ograniczy zanieczyszczenie kulkami dzięki mniejszemu zużyciu części.
8. Uruchom pompę za pomocą jednostki sterującej. Natężenie przepływu można dostosować zgodnie z wymaganiami dla danej formulacji (~ 50 - 150 mL/min).
9. Włącz mieszadło i dostosuj prędkość w jednostce sterującej. W urządzeniu MicroCer prędkość można zwiększyć z 620 rpm do 4320 rpm. Monitoruj temperaturę za pomocą wskaźnika temperatury zamontowanego na górze komory mielącej i upewnij się, że nie dochodzi do przegrzania.
10. Miel próbkę przy różnych prędkościach i natężeniach przepływu, pobierając niewielkie aliquoty (~1 mL) formulacji do pomiarów wielkości i ładunku za pomocą dyfuzyjnego rozpraszania światła Brookhaven Zetasizer (Tabela 1).
11. Po uzyskaniu pożądanej wielkości cząstek zatrzymaj mielenie za pomocą jednostki sterującej. Przy wciąż włączonej pompie zbierz próbkę do kolby. Pozwól lekowi całkowicie spłynąć do kolby zbierającej próbki.
12. Wyłącz pompę. Aby usunąć kulki, umieść tace zbierającą pod urządzeniem. Poluzuj nakrętki na przedniej płycie zestawu pokrywy i zbierz kulki do tacy. Zdejmij przednią płytę i użyj butelki z wodą dejonizowaną, aby wypłukać kulki do tacy.
13. Przenieś zmieloną zawiesinę do probówek wirówkowych o pojemności 50 mL i ustaw wirówkę na 10,000 rpm (10,174 rcf) na 30 minut. Po zakończeniu cyklu wirowania zmierz objętość supernatantu i zastąp go taką samą ilością świeżego roztworu surfaktantu.
14. Po zakończeniu resuspensji przenieś zawiesinę do komory mielącej i miel przez 10 minut. Pobierz aliquot (~ 1mL) i ponownie zmierz wielkość oraz ładunek próbki za pomocą Zetasizera (Tabela 1).
15. Przeprowadź czyszczenie urządzenia MicroCer po użyciu, stosując wodę dejonizowaną i 70% etanol.
16. Zmierz stężenie nanoformulacji nanoART za pomocą HPLC. W naszym przypadku próbki analizowano metodą HPLC w fazie odwróconej, wykonując potrójne wtryski 20 μL na kolumnę YMC Octyl C8 (Waters Inc., Milford, MA) z kartridżem ochronnym C8. Fazę ruchomą składającą się z 48% acetonitrylu / 52% 25mM KH₂PO₄ o pH 4.15 pompowano z prędkością 0.4 mL/min z detekcją UV/Vis przy 272 nm. Dla wszystkich pomiarów leku ilościowe oznaczenie ustalano poprzez porównanie z krzywą wzorcową każdego wolnego leku (0.025-100 μg/ mL) przygotowaną w metanolu.

2. Homogenizacja NanoART przy użyciu Avestin EmulsiFlex C5

1. Za pomocą wagi analitycznej odważyć kryształy leku oraz różne surfaktanty, które zostaną wykorzystane do przygotowania nanoformulacji, a następnie zmieszać je z buforem Hepes 10 mM o pH 7,8 za pomocą miksera T-18 Ultraturrax w celu uzyskania pełnej dyspersji.
2. Przenieść zawiesinę do naczynia homogenizującego i rozpocząć recyrkulację. Przed rozpoczęciem homogenizacji próbki upewnić się, że chłodnica jest włączona.
3. Stopniowo zwiększać ciśnienie, aż miernik wskaże 20 000 ± 2 000 psi, i kontynuować homogenizację do momentu uzyskania docelowego rozmiaru cząstek. Zazwyczaj trwa to od 45 do 60 minut. Okresowo pobierać alikwot (~ 1 mL) i mierzyć rozmiar oraz ładunek próbki za pomocą Zetasizera (Tabela 1).
4. Przenieść zhomogenizowaną zawiesinę z homogenizatora do probówek wirówkowych o pojemności 50 mL i ustawić wirówkę na 10 000 rpm (10 174 rcf) na 30 minut. Po zakończeniu cyklu wirowania zmierzyć objętość supernatantu i zastąpić go równą objętością świeżego roztworu surfaktantu.
5. Po ponownym zawieszeniu przenieść zawiesinę do homogenizatora C5. Wznowić cyrkulację, przywrócić ciśnienie homogenizacji do 20 000 ± 2 000 psi i homogenizować przez 30 minut. Zmierzyć rozmiar i ładunek formulacji za pomocą Zetasizera (Tabela 1).
6. Przeprowadzić czyszczenie urządzenia po pracy, używając wody dejonizowanej i etanolu jako rozpuszczalnika.
7. Zmierzyć stężenie próbek za pomocą metody HPLC.

3. Sonikacja przy użyciu procesora ultradźwiękowego Cole Parmer

1. Odmierz 50 mL dichlorometanu do zlewki szklanej. Odważ 6 g kopolimeru kwasu mlekowego i glikolowego (PLGA) za pomocą wagi analitycznej, dodaj do dichlorometanu i mieszaj do całkowitego rozpuszczenia.
2. Odważ 1,25 g kryształów leku i dodaj do roztworu dichlorometanu/PLGA. Mieszaj do uzyskania całkowitego rozpuszczenia.
3. Przygotuj 1% roztwór surfaktanta z alkoholu poliwinylowego (PVA) i schłodź go w kąpieli lodowej. Przed dodaniem organicznego roztworu zawierającego rozpuszczony lek upewnij się, że roztwór surfaktanta jest schłodzony.
4. Wlej roztwór leku do 1% roztworu surfaktanta PVA i uruchom sonikator ultradźwiękowy z amplitudą 50%. Upewnij się, że roztwór surfaktanta znajduje się w kąpieli lodowej. W przypadku mniejszych partii próbek amplitudę sonikatora można zmniejszyć do ok. 30%. Sonikuj próbkę przez 10 minut.
5. Pobierz niewielką alikwot (~ 1 mL) do analizy wielkości cząstek (Tabela 1). Jeśli wielkość cząstek przekracza 1,5 μm, sonikuj próbkę w odstępach 2-minutowych do maksymalnie 16 minut łącznie. Obserwuj próbki pod mikroskopem przy powiększeniu 20x i udokumentuj obserwacje (Rycina 1A).
6. Użyj mieszadła magnetycznego, aby wytworzyć odpowiedni wir w pozostałej zawiesinie, i kontynuuj mieszanie przez noc w temperaturze pokojowej.
7. Odważ 8 g mannitolu do kolby i dodaj 80 mL wody RO. Mieszaj do całkowitego rozpuszczenia i przechowuj w temperaturze pokojowej. Roztwór ten posłuży do resuspensji po wirowaniu, jeśli próbki będą wymagały liofilizacji.
8. Zbierz zawiesinę po 24 godzinach i przelej do probówek do wirowania o objętości 50 mL. Odwiruj próbki z prędkością 8 000 rpm przez 20 minut w temperaturze 5°C. Odlej nadsącz i resuspenduuj jedną połowę próbki w 75 mL filtrowanej wody z odwróconej osmozy (RO), a drugą połowę w 75 mL 0,5% surfaktanta bromku cetylotrimetyloamoniowego (CTAB).
9. Ponownie odwiruj próbki z prędkością 8 000 rpm przez 20 minut w temperaturze 5°C i resuspenduuj każdy z osadów w łącznie 20 mL roztworu mannitolu.
10. Po drugiej resuspensji zmierz wielkość cząstek za pomocą Zetasizera (Tabela 1).
11. Przenieś pozostałą zawiesinę do odpowiednich fiolek i umieść je w liofilizatorze.
12. Zmierz stężenie próbek za pomocą metody HPLC.

4. Morfologia NanoART

1. Należy pobrać zawiesinę nanoART i krótko poddać sonikacji z amplitudą 20% przez 5 sekund za pomocą sondy sonikacyjnej. Przenieść 10 μL zawiesiny do 1,5 mL wody RO w probówce do mikrocentryfugi o pojemności 1,7 mL i mieszać w wirówce vortex przez 10 sekund.
2. Pobrać próbkę 50 μL roztworu water-nanoART i przenieść ją do aparatury filtracyjnej składającej się z polipropylenowego uchwytu filtra Swinnex 13 z zamontowaną poliwęglanową membraną filtracyjną 0,2 μm (Nuclepore Track-Etched). Aparaturę filtracyjną należy wstępnie przygotować, przepuszczając 50 μL filtrowanej przez membranę 0,2 μm wody destylowanej przed dodaniem rozcieńczonej zawiesiny leku. Następnie należy zastosować próżnię w aparaturze, aż cała objętość roztworu zostanie całkowicie wciągnięta przez membranę filtracyjną.
3. Po wyschnięciu membrana zostaje przymocowana do aluminiowego trzpienia (stub) za pomocą dwustronnej przewodzącej taśmy węglowej i napylona palladem. Następnie próbkę obrazuje się przy użyciu, w naszym przypadku, niskonapięciowego skaningowego mikroskopu elektronowego z emiterem polowym JEOL JSM6300F (Rycina 2).

5. Wizualizacja NanoART

1. Przygotowane zawiesiny nanoART poddać sonikacji przez 10 sekund przy amplitudzie 20% za pomocą sondy sonikacyjnej.
2. Wziąć szkiełko nakrywkowe i umieścić je na mikroskopie odwróconym. Na szkiełku nakrywkowym zmieszać 15 μL zawiesiny nanoART z 100 μL soli fizjologicznej w buforze fosforanowym (PBS), mieszając poprzez kilkukrotne pipetowanie. Nanocząstki zobrazować przy użyciu obiektywu 20x (Rysunek 3).

Biologia nanoART

6. Izolacja i przygotowanie monocytów z krwi oraz makrofagów pochodzenia monocytarnego (MDM)

1. Pozyskać ludzkie monocyty od dawców seronegatywnych pod kątem HIV-1 i zapalenia wątroby za pomocą leukaferezy, a następnie oczyścić komórki metodą przeciwprądowej elutracji odśrodkowej. Czystość komórek ocenić za pomocą immunoznakowania przeciwciałem anty-CD68 (klon KP-1) na preparatach cytospin barwionych metodą Wrighta 1.
2. Hodować oczyszczone monocyty w pośrodku DMEM uzupełnionym o 10% inaktywowanego ciepłem pulowanego surowicy ludzkiej, 1% glutaminy, 50 μg/ mL gentamycyny, 10 μg/ mL cyprofloksacyny oraz 1000 U/ mL rekombinowanego ludzkiego czynnika stymulującego wzrost kolonii makrofagów (MCSF) w stężeniu 1x10⁶ komórek/ mL w temperaturze 37°C w atmosferze nawilżonej z 5% CO₂. Wysiać 2x10⁶ komórek na dołek w płytkach 6-dołkowych i hodować komórki przez 7 dni, aby umożliwić różnicowanie się monocytów w makrofagi 1. (Rysunek 3A)

7. Pobieranie i zbieranie komórek

1. Wymieszać nanoART z pożywką hodowlaną (bez MCSF) do stężenia końcowego 100 μM i dodać 1 mL pożywki z preparatem do każdej dołka.
2. W wybranym punkcie czasowym lub po całkowitym wchłonięciu nanoART przez komórki (Rycina 2), usunąć całą pożywkę z preparatem i przemyć komórki 3 razy 1 mL PBS, aby usunąć cząsteczki, które nie zostały pobrane przez komórki. Za pomocą scrapera (cell lifter) zebrać komórki przylegające z dna dołka w 1 mL PBS i przenieść je do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,7 mL 2-4.
3. Odwirować komórki przy 1,000 rcf w temperaturze 4°C przez 10 minut. Usunąć supernatant i dodać 200 μL 100% metanolu. Zlizować komórki i rozpuścić nanoART, poddając osad krótkotrwałej (2-5 sekund) sonikacji za pomocą sondy ultradźwiękowej przy amplitudzie 20%. Przechowywać próbki w temperaturze -80°C do momentu analizy zawartości leku.

8. Wewnątrzkomórkowa retencja NanoART

1. Poddać MDM działaniu zgodnie z opisem w punkcie 7.1.
2. W wybranym punkcie czasowym przemyć komórki zgodnie z opisem w punkcie 7.2; jednak zamiast natychmiastowego zdrapywania komórek, utrwalić je przez 15 min w temperaturze pokojowej w roztworze 3% glutaraldehydu w 0,1 M buforze fosforanowym (pH 7,4), a następnie utrwalić dodatkowo przez 10 minut za pomocą 1% cztero-tlenku osmu w 0,1 M buforze fosforanowym (pH 7,4).
3. Usunąć utrwalacz i zdrapać komórki w 1 mL PBS zgodnie z opisem w punkcie 7.2. Następnie zebrać i odwirować komórki zgodnie z opisem w punkcie 7.2; jednak zamiast dodawania metanolu do osadu, dodać 200 μL roztworu utrwalającego z glutaraldehydem.
4. Przyciąć osad komórkowy na cienkie (80 nm) sekcje za pomocą mikrotomu. Zabarwić sekcje octanem uranylu i cytrynianem ołowiu. Obserwować zabarwione sekcje przy użyciu transmisyjnego mikroskopu elektronowego (Rycina 4).

9. Uwalnianie ART

1. Poddać komórki działaniu zgodnie z opisem w punktach 7.1-7.2; jednak zamiast zbierać komórki po płukaniu, zastąpić PBS 2 mL pożywki hodowlanej bez MCSF i bez nanoART.
2. W określonych dniach lub w przypadku zmiany koloru pożywki hodowlanej na żółty, wymienić połowę pożywki.
3. W wybranym dniu zebrać 1 mL pożywki komórkowej wraz z powielonymi komórkami zgodnie z opisem w punktach 7.2-7.3.
4. Przetworzyć komórki zgodnie z opisem w punkcie 7.3. Przetworzyć pożywkę, dodając 150 μL próbki pożywki do 1 mL 100% metanolu i mieszając w wortexie z pełną prędkością przez 10 sekund. Następnie odwirować próbki przy 21 000 rcf przez 10 minut. Zebrać nadfiltr i przenieść go do nowej probówki. Odparować metanol za pomocą wirówki próżniowej; proces ten może trwać od 1 do 4 godzin w zależności od próbki. Próbki przechowywać w temperaturze -80°C do czasu przeprowadzenia analizy leków.

10. Obserwacja pobierania NanoART w czasie rzeczywistym za pomocą mikroskopii konfokalnej

1. Pobrać dojrzałe MDM z kroku 6.2 i oznakować komórki, używając roztworu do znakowania komórek, takiego jak Vybrant Cell Labeling Solution, zgodnie z instrukcją producenta. Przepłukać komórki 3 razy, używając 1 mL pożywki hodowlanej, aby usunąć nadmiar barwnika.
2. Wymieszać nanoART z pożywką hodowlaną, tak jak w kroku 7.1, używając nanoART znakowanych fluorescencyjnie.
3. Dodać pożywkę z traktowaniem zawierającą znakowany nanoART bezpośrednio przed obrazowaniem za pomocą mikroskopu konfokalnego. Wykonywać zdjęcia co 30 sekund przez 4 godziny, używając obiektywu 60x (Filmy 1 i 2).

Testy zakażenia i zakaźności HIV-1

11. Zakażenie HIV-1_ADA

1. Poddać komórki działaniu odczynników zgodnie z opisem w punktach 9.1-9.3.
2. W wybranych dniach usunąć całe medium i zastąpić je medium bez MCSF, zawierającym HIV-1_ADA przy wielokrotności zakażenia (MOI) wynoszącej 0,01 cząsteczek wirusa/komórkę i inkubować przez 24 godziny 1. Usunąć medium z wirusem i zastąpić je świeżym medium wolnym od wirusów. Hodować komórki przez 10 dni, wymieniając połowę medium co drugi dzień lub w razie potrzeby, aby utrzymać żywotność komórek (Rycina 5) 6.
3. Dziesięć dni po zakażeniu pobrać 10 μL medium z każdej studzienki, przenieść do płytki 96-dołkowej i przechowywać w temperaturze -80°C do czasu przeprowadzenia analizy odwrotnej transkryptazy retrowirusowej.

12. Analiza aktywności odwrotnej transkryptazy (RT)

1. Do każdej 10 μL próbki z kroku 11.3 dodać i wymieszać 10 μL roztworu zawierającego 100 mM Tris-HCl (pH 7,9), 300 mM KCl, 10 mM DTT, 0,1% nonyl fenoksypolietoksyloetanolu-40 (NP-40) oraz wodę. Mieszaninę inkubować przez 15 minut w temperaturze 37°C 7.
2. Następnie do każdej studni dodać 25 μL roztworu zawierającego 50 mM Tris-HCl (pH 7,9), 150 mM KCl, 5 mM DTT, 15 mM MgCl₂, 0,05% NP-40, 10 μg/ mL poly (A), 0,250 U/ mL oligo d(T)_12-18 oraz 10 μCi/ mL ³H-TTP i inkubować w temperaturze 37°C przez 18 godzin 7.
3. Po inkubacji do każdej studni dodać 50 μL lodowatego 10% kwasu trójchlorooctowego (TCA). Zawartość studni przenieść na filtry z włókna szklanego, a następnie ocenić stopień wbudowania ³H-TTP za pomocą spektroskopii β-scyntylacyjnej 7.

13. Wykrywanie białka HIV-1p24

1. Przemyć komórki powtórne, z których w kroku 11.3 pobrano próbkę medium do transkryptazy retrowirusowej, płucząc je 3 razy 1 mL PBS.
2. Utrwalić komórki w 4% paraformaldehydzie przez noc w temperaturze 4°C. Następnego ranka przemyć komórki 3 razy PBS.
3. Użyć mysich przeciwciał monoklonalnych przeciwko HIV-1 p24 (1:10, Dako, Carpinteria, CA), aby zwizualizować infekcję HIV. Wykonać obrazy komórek w polu jasnym, używając obiektywu 40x (Rycina 6).

14. Reprezentatywne wyniki:

Lek	Rozmiar (nm)	PDI	Ładunek (mv)	Surfaktanty
IDV	1052	0.286	-24.58	0.5% P188, 5.0% SDS, 9.25% sacharozy
RTV	233	0.273	-7.47	0.5% P188, 9.25% sacharozy
ATZ	840	0.192	+25.47	0.5% P188, 0.1% mPEG 2000-DSPE, 1.0% DOTAP, 9.25% sacharozy
EFV	347	0.235	-13.52	1.0 % PVA

Tabela 1. Charakterystyka fizyczna nanoART
Tabela przedstawia potencjalne wartości reprezentatywne dla charakterystyki fizycznej formulacji nanoART przygotowanych z użyciem wskazanych surfaktantów. Wartości obejmują średnicę średnią na podstawie intensywności rozproszonego światła, indeks polidyspersyjności (PDI, szacunek rozkładu wielkości cząstek) oraz wartości potencjału zeta uzyskane dla różnych próbek nanoproformulacji. Skróty użyte w tabeli: IDV: indynawir; RTV: rytonawir; ATV: atazanawir; EFV: efawiwerenz; PVA: poliwinyloalkohol; SDS: dodecylosiarczan sodu; P188: poloksamer 188 (nazywany również Pluronic F68); mPEG 2000-DSPE: metylo-poli(glikol etylenowy)1,2-distearoylo-fosfatydyloetanoloamina; DOTAP: (1-oleoil-2-[6-[(7-nitro-2-1,3-benzoksadiazol-4-ylo) amino]heksanoylo]-3-trimetyloamoniowy propan.

RYSUNEK 1. Schemat blokowy podsumowujący różne metody wytwarzania nanoART.
Rysunek 1 podsumowuje różne metody stosowane do wytwarzania nanoART. Schemat blokowy zawiera przewidywany czas przydzielony na każdą z krytycznych faz poszczególnych metod.

RYCINA 2. Reprezentatywne obrazy pożądanej i niepożądanej morfologii NanoART. Analiza za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej (powiększenie 15 000X) nanoART RTV otrzymanych w drodze homogenizacji, mielenia na mokro i sonikacji na membranie filtracyjnej z poliwęglanu o porach 0,2 μm. Pasek skali odpowiada 2,0 μm we wszystkich kadrach. Pożądane nanoART składają się średnio z małych (≤ 2 μm) odrębnych cząsteczek o gładkich krawędziach, które mają tendencję do przybierania tego samego lub podobnego kształtu. Niepożądane nanoART znacznie różnią się zarówno rozmiarem, jak i kształtem, a ponadto mogą się łączyć i/lub przyklejać do siebie.

RYCINA 3. Obrazy pożądanego roztworu nanoART oraz MDM pobierających nanoART. Obrazy z mikroskopii w polu jasnym (wszystkie wykonane przy użyciu obiektywu 20x) zhomogenizowanych RTV-NP oraz MDM pobierających nanoART. Po połączeniu 10 μL roztworu RTV-NP z 100 μL PBS na szkiełku nakrywnym, cząsteczki są widoczne i przypominają piasek, przy czym tylko kilka większych cząsteczek można zidentyfikować indywidualnie (A). Obraz w pełni zróżnicowanych, wrzecionowatych MDM przed traktowaniem nanoART (B). Po pobraniu nanoART przez komórki stają się one ciemniejsze, a ich jądra stają się bardziej widoczne ze względu na perinuklearny rozkład nanoART; zachowują one jednak wrzecionowaty kształt ciała komórkowego (C). Gdy komórki zostaną przeładowane nanoART, jądra stają się niewidoczne, a komórki przyjmują kształt kulisty, tracąc strukturę wrzecionowatą i potencjalnie odrywając się od dna dołka (D).

RYCINA 4. Potwierdzenie wbudowania nanoART do wnętrza MDM. Transmisyjna mikroskopia elektronowa (powiększenie 15 000x) wykazuje pobieranie nanoART przez MDM eksponowane na RTV-NP otrzymane metodą homogenizacji (A), RTV-NP otrzymane metodą mielenia na mokro (B), RTV-NP otrzymane metodą sonikacji (C) oraz komórki niepoddane działaniu nanocząsteczek (D). Wewnątrz komórek nanoART powinny być łatwo identyfikowalne ze względu na ich geometryczny kształt. Zwróć uwagę na brak jakichkolwiek wyraźnych struktur geometrycznych w komórce kontrolnej (D). Przykładowe cząstki zostały obrysowane: czerwonym kolorem dla homogenizacji (A), niebieskim dla mielenia na mokro (B) oraz zielonym dla sonikacji (C). Struktura cząstek powinna odpowiadać tej zaobserwowanej w SEM. Pasek skali w każdej ramce wynosi 5.0 μm.

RYSUNEK 5. Schemat metody badania skuteczności przeciwwirusowej nanoART. Aby sprawdzić zdolność nanoART do hamowania replikacji wirusa, MDM muszą zostać najpierw poddane działaniu nanoART, a następnie wyeksponowane na HIV-1_ADA. Podobnie jak w badaniach uwalniania ART, MDM są obciążane nanoART, a następnie przemywane w celu usunięcia cząsteczek, które nie zostały zinternalizowane. MDM obciążone nanoART są następnie hodowane do 15 dni, z wymianą połowy medium co drugi dzień. W tym czasie (zazwyczaj w dniach 1, 5, 10 i 15) MDM są poddawane ekspozycji na HIV-1_ADA. Po każdej ekspozycji na wirusa komórki są hodowane przez kolejne 10 dni, aby umożliwić postęp infekcji. W 10. dniu po infekcji pobierane są próbki medium do analizy RT, a komórki są utrwalane i barwione na antygen p24. Równolegle hodowane są również MDM niepoddane działaniu nanoART, zarówno zainfekowane, jak i niezainfekowane, które są badane pod kątem obecności antygenu p24 i aktywności RT.

RYSUNEK 6. Badanie skuteczności nanoART w MDM zainfekowanych HIV-1 za pomocą barwienia p24. Obrazy w polu jasnym (obiektyw 20x) MDM traktowanych RTV-NP 10 dni po ekspozycji na HIV-1_ADA. Brak infekcji w przypadku ekspozycji komórek na wirusa 1 dzień po zastosowaniu nanoART (A); zwróć uwagę na obecność NP w cytoplazmie większości komórek (wstawka A wskazana strzałkami). Infekcja wystąpiła, gdy komórki zostały wystawione na działanie wirusa 10 dni po zastosowaniu nanoART (B), choć w znacznie mniejszym stopniu niż w komórkach nie traktowanych nanoART (D); zwróć uwagę na utrzymującą się obecność NP w niektórych komórkach (wstawka B wskazana strzałkami), lecz w mniejszej liczbie niż w 1. dniu po zastosowaniu nanoART (wstawka A). Obraz komórek, które nie były traktowane nanoART ani nie zostały zainfekowane (C); zwróć uwagę na brak NP w cytoplazmie komórek (wstawka C). Obraz komórek, które nie były traktowane nanoART, lecz wystawiono je na działanie HIV-1_ADA (D).

WIDEO 1. Konfokalna mikroskopia żywych komórek wykazująca słabe pobieranie RTV-NP przez MDM. Mikroskopia fluorescencyjna MDM znakowanych na zielono roztworem do znakowania komórek Vybrant DiO i traktowanych znakowanymi na czerwono RTV-NP. Obrazy były pobierane co 30 sekund przez 4 godziny przy powiększeniu 60x. Kliknij tutaj, aby obejrzeć wideo

WIDEO 2. Konfokalna mikroskopia żywych komórek obrazująca skuteczne pobieranie RTV-NP przez MDM. Mikroskopia fluorescencyjna MDM znakowanych na zielono roztworem do znakowania komórek Vybrant DiO i poddanych działaniu RTV-NP znakowanych na czerwono. Obrazy pobierano co 30 sekund przez 4 godziny przy powiększeniu 60x. Kliknij tutaj, aby obejrzeć wideo

Dyskusja

NanoART zostały zaprojektowane w celu usprawnienia terapii HIV-1. Zaproponowaliśmy system dostarczania leków oparty na monocytach i makrofagach jako pierwszy krok w stronę opracowania takich technologii do zastosowań klinicznych oraz jako laboratoryjny system testowy do rozwoju leków w formie nanoformułacji. Nasze wcześniejsze prace wykazały, że system ten nadaje się do takiego zastosowania^5,6.

W niniejszym opracowaniu przedstawiono metody syntezy NP powszechnie stosowanych leków przeciwko HIV-1 (indynawiru, IDV; rytonawiru, RTV; efawiirenzu, EFV oraz atazanawiru, ATV). Osiągnięto to poprzez mielenie na mokro, homogenizację i sonikację. Co istotne, nasze podejście pozwala na modyfikację charakterystyk fizycznych nanoART, takich jak rozmiar, kształt i ładunek ^5,6. Poprzez staranny dobór surfaktantów można kontrolować ładunek cząsteczki w zakresie od silnie ujemnego, przez neutralny, aż po silnie dodatni. Poprzez zmianę czasu i intensywności procesu można kontrolować rozmiar, uzyskując cząsteczki o wielkości od ≤ 200 nm do ≥ 3 μm. Kształt cząsteczki również można kontrolować, choć w mniejszym stopniu niż pozostałe charakterystyki fizyczne. Na przykład cząsteczki sferyczne można wytworzyć poprzez sonikację z polimerami, natomiast wieloboczne kształty geometryczne można uzyskać za pomocą mielenia na mokro lub homogenizacji. Mielenie na mokro i homogenizacja dają cząsteczki o różnych kształtach, jednak proces ten zależy od metody frakcjonowania i nie może być bezpośrednio kontrolowany. Właściwości tych metod wytwarzania mogą umożliwić badaczom łatwe otrzymywanie nanoART zgodnie z dokładnymi specyfikacjami projektowymi. Jest to niezwykle ważne, ponieważ właściwości fizykochemiczne nanoART mają silny wpływ zarówno na ich stabilność, jak i na sposób oddziaływania z komórkami. Wykazaliśmy na przykład, że nanoART o rozmiarze około 1 μm, silnym ładunku dodatnim i wielobocznym kształcie geometrycznym są szybciej pobierane przez makrofagi, są bardziej stabilne po dostaniu się do wnętrza komórek i uwalniane w dłuższym okresie czasu 6.

Opracowano metodę testowania nanoART, która umożliwia proste badanie zdolności cząsteczek do być pobieranych, zatrzymywanych i uwalnianych przez makrofagi — jedne z głównych komórek docelowych HIV-1 — a także ich zdolności do hamowania replikacji wirusa. Pozwala to na łatwe różnicowanie nanoART na podstawie ich wydajności i zidentyfikowanie tych, które mają największą szansę na sukces w modelu in vivo, co zwiększa zarówno efektywność, jak i szybkość opracowywania nanoART do zastosowań u ludzi.

Wykazano, że makrofagi z szpiku kostnego myszy, załadowane ex vivo preparatem nanoART i przeniesione adoptywnie poprzez wtryskiwanie dożylne do myszy zhumanizowanych zainfekowanych HIV-1, mogą przemieszczać się do miejsc aktywnej infekcji, w tym do ośrodkowego układu nerwowego, i uwalniać leki przez okres do 2 tygodni w celu zahamowania replikacji wirusa^2-4. Ponadto komórki załadowane nanoART były w stanie skutecznie zredukować liczbę zainfekowanych wirusem komórek w osoczu, węzłach chłonnych, śledzionie, wątrobie i płucach, a także chronić komórki CD4+². Badania te, choć wstępne, dowodzą, że komórkowy system dostarczania nanoART może rozprowadzić klinicznie istotne ilości leku zarówno do krwi, jak i do zainfekowanych tkanek. Ze względu na obiecujące wstępne wyniki badań na myszach zainfekowanych HIV-1, obecnie opracowujemy model makaków zainfekowanych wirusem niedoboru odporności u naczelnych, aby dalej testować potencjał nanoART do zastosowań klinicznych.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
nanoART Produkcja< / strong>
Odczynnik siarczanu indynawiru		Longshem Co., Szanghaj, Chiny	Cas # 157810-81-6
Odczynnik Ritonavir		China Shengda Pharmaceutical Company, Chiny	Cas # 155213-67-5
Odczynnik siarczanu atazanawiru		Gyma Laboratories of America INC	Cas # 198904-31-3
Odczynnik Effavirenz		Hetero Labs LTD, Indie	Cas # 154598-52-4
Odczynnik	PVA	Sigma-Aldrich	P 8136
Odczynnik SDS		Bio-Rad	161-0301
Odczynnik do sacharozy		Fluka	84097
P188	Odczynnik	Sigma-Aldrich	P 1300
Odczynnik mPEG 2000-DSPE		Genzyme	LP-R4-039
Odczynnik Dotap		Avanti Polar Lipid, Inc	890890 P
Odczynnik Hepes		Sigma-Aldrich	83264
PLGA 75:25	Odczynnik	Sigma-Aldrich	P1941
Odczynnik dichlorometanu		Acros Organics	75-09-2
Odczynnik mannitol		Sigma-Aldrich	M9546
Odczynnik	CTAB	Sigma-Aldrich	H 9151
Narzędzie do wagi analitycznej	Denver	Instrument
T-18	Mieszalnik Narzędzie	IKA
Ultra Sonicator		Cole-Parmer
Mielenie na mokro, Narzędzie MicroCer		Netzsch Fine Particle Technology, LLC
Homogenizator, EmulsiFlex-C5	Tool	Avestin, Inc.
Narzędzie do pomiaru poziomopotencjometru		Malvern Instruments
Narzędzie do systemu kolektora gazowego		Victor Technologies
Testowanie in vitro
DMEM		Mediatech, Inc.	10-013-CV
Odczynnik gentamycyny		Invitrogen	15710-064
Odczynnik	cyprofloksyna	Sigma-Aldrich	17850
Odczynnik MCSF dla ludzi		Miltenyi Biotec	130-093-964
odczynnik	surowicy ludzkiej	Cole-Parmer	WU-88061-68
6-dołkowe płytki do hodowli tkankowych	Narzędzie	Corning	3524
Metanol (klasa HPLC)	Odczynnik	Fisher Scientific	A452SK-4
1,7 ml probówki do mikrowirówek	Narzędzie	National Scientific Company	CN1700GT
Roztwór aldehydu glutarowego	Odczynnik	Sigma-Aldrich	49632
Roztwór tetratlenku osmu	Odczynnik	Sigma-Aldrich	75632
Wirówka 5417R	Narzędzie	Eppendorf	022621807
F-45-30-11 wirnik o stałym kącie	Narzędzie	Eppendorf	022636006
HIV-1ADA	Reagent
HIV-1 p24 mysie przeciwciało monoklonalne	Odczynnik	Dako	M0857
Osłona szkiełka mikroskopu	ślizga się Narzędzie	Fisher Scientific	12-548-5P
Skróty użyte w tabeli: IDV: indynawir; RTV: rytonawir; ATV: atazanawir; EFV: effavirenz; PVA: alkohol poliwinylowy; SDS dodecylosiarczan sodu; P188: poloksamer 188 (określany również jako Pluronic F68); mPEG 2000-DSPE: metylo-poli(glikol etylenowy)1,2-distearoilo-fosfatydylo-etanoloamina; DOTAP: (1-oleoilo-2-[6-[(7-nitro-2– 1,3-benzoksadiazol-4-ylo)amino]heksanoilo]-3-trimetyloamoniowy propan); PLGA: poli(kwas mlekowo-ko-glikolowy); CTAB: bromek cetylotrimetyloamoniowy; DMEM: Dulbecco' s Zmodyfikowany Eagle Medium; MCSF: Czynnik stymulujący tworzenie kolonii makrofagów; HPLC: wysokociśnieniowa chromatografia cieczowa; HIV-1: Ludzki wirus niedoboru odporności-1