Wysokoprzepustowy screening aktywności celulazy w procesie biominingu z bibliotek metagenomicznych

Podsumowanie

Niniejszy protokół opisuje wysokoprzepustowy screening aktywności celulolitycznej z biblioteki metagenomicznej eksprymowanej w Escherichia coli. Screening opiera się na analizie w roztworze, jest wysoce zautomatyzowany i wykorzystuje chemię jednopojemnikową w mikropłytkach 384-dołkowych, z końcowym odczytem w postaci pomiaru absorbancji.

Streszczenie

Celuloza, będąca najobfitszym źródłem organicznego węgla na planecie, znajduje szerokie zastosowania przemysłowe, przy czym coraz większy nacisk kładzie się na produkcję biopaliw ¹. Chemiczne metody modyfikacji lub degradacji celulozy zazwyczaj wymagają zastosowania silnych kwasów i wysokich temperatur. W związku z tym metody enzymatyczne zyskały na znaczeniu w procesach biokonwersji. Choć identyfikacja aktywnych celulaz z izolatów bakteryjnych i grzybowych była w pewnym stopniu skuteczna, zdecydowana większość mikroorganizmów występujących w naturze wykazuje oporność na hodowlę laboratoryjną. Podejścia oparte na screeningu genomiki środowiskowej, znanej również jako metagenomika, dają duże nadzieje na wypełnienie luki w hodowli podczas poszukiwań nowych enzymów biokonwersji. Metody screeningu metagenomicznego z sukcesem pozwoliły na wyizolowanie nowych celulaz ze środowisk tak zróżnicowanych jak gleby ², żwacz bawoła ³ oraz jelito końcowe termitów ⁴, z wykorzystaniem szalek z agarem z karboksymetylocelulozą (CMC) barwionym czerwoną czerwienią Kongo (według metody Teathera i Wooda ⁵). Jednak metoda z wykorzystaniem CMC charakteryzuje się ograniczoną przepustowością, nie jest ilościowa i wykazuje niski stosunek sygnału do szumu ⁶. Opisano inne metody ^7,8, lecz każda z nich opiera się na testach na płytkach agarowych, co jest niepożądane w przypadku screeningu wysokoprzepustowego dużych bibliotek genomowych z dużymi insertami. Tutaj przedstawiamy metodę screeningu aktywności celulazy w roztworze z wykorzystaniem chromogennego substratu dinitrofenolo-celobiozydu (DNP) ⁹. Nasza biblioteka została sklonowana do fosmidu pCC1 z kontrolą liczby kopii w celu zwiększenia czułości testu poprzez indukcję liczby kopii ¹⁰. Metoda ta wykorzystuje chemię typu one-pot w mikropłytkach 384-dołkowych, a końcowy odczyt jest realizowany jako pomiar absorbancji. Odczyt ten jest ilościowy, czuły i zautomatyzowany, z przepustowością do 100 płytek 384-dołkowych dziennie przy użyciu automatycznego dozownika cieczy i czytnika płytek z dołączonym systemem nakładania płytek.

Protokół

Przed rozpoczęciem tego protokołu należy przygotować bibliotekę metagenomiczną przechowywaną w formacie płytek 384-dołkowych. W naszym badaniu zastosowaliśmy wektor fosmidowy pCC1 z kontrolą kopii w połączeniu z komórkami E. coli TransforMax EPI30-T1^R opornymi na fagi T1 jako gospodarza biblioteki; płytki przechowywaliśmy w temperaturze -80°C ¹.

1. Replikacja płytek biblioteki metagenomicznej

1. Rozmrozić płytki zawierające bibliotekę w temperaturze 37°C przez około 20 minut lub do momentu rozmrożenia wszystkich dołków.
2. Użyć funkcji sterylizacji światłem UV w urządzeniu qPix2, aby wysterylizować robota przez 15 minut.
3. Przygotować bulion LB z chloramphenicolem w końcowym stężeniu 12,5ug/mL i arabinozą w stężeniu 10ug/mL w butelce na odczynniki o pojemności 50mL. Każda płytka zużyje około 20mL; należy przygotować dodatkowe 50mL, aby uwzględnić objętość martwą.
4. Skonfigurować urządzenie qFill3 zgodnie z instrukcjami producenta, podłączając butelkę z pożywką do rozdzielacza za pomocą sterylnych przewodów. Zaprogramować urządzenie na odpowiednią ilość pożywki i ustawić wypełnianie każdego dołka objętością 45uL.
5. Usunąć powietrze z przewodów i rozdzielacza, korzystając z funkcji przeczyszczania (purge) robota, aż pożywka stanie się widoczna przy każdym pinie rozdzielacza.
6. Wypełnić żądaną liczbę płytek pożywką LB za pomocą qFill3. Wypełnienie każdej płytki zajmuje około 20 sekund.
7. Włożyć płytki z biblioteką oraz świeże płytki do odpowiednich obszarów robota qPix2. Napełnić kąpiele czyszczące odpowiednimi odczynnikami: 2% Micro90 w tylnej kąpieli, autoklawowaną wodą destylowaną w środkowej kąpieli oraz 80% etanolem w przedniej kąpieli.
8. Użyć programu „Replicating” w qPix2. W oprogramowaniu wybrać odpowiednią głowicę, liczbę i rodzaje płytek źródłowych oraz płytek docelowych. Skonfigurować głowicę tak, aby była czyszczona pomiędzy replikacjami; zazwyczaj wystarczające jest 6 cykli w każdej kąpieli. Wydajność maszyny wynosi 10 płytek jednocześnie, a replikacja wszystkich z nich za pomocą głowicy 384-pinowej zajmuje około 15 minut (lub około 50 minut z głowicą 96-pinową).
   Uwaga: Dostępna jest opcja „Stir Source” lub „Stir Destination”. Zaleca się niekorzystania z tych opcji, ponieważ w naszym robocie występowały z nimi problemy.
9. Po zreplikowaniu płytek inkubować je w temperaturze 37°C przez 24 godziny w komorze wilgotnościowej. Ze względu na indukcję wysokiej liczby kopii fosmidu poprzez dodatek arabinozy, klony mają tendencję do wolniejszego wzrostu niż klony nieindukowane. Płytki z biblioteką należy przenieść z powrotem do -80°C.
   Uwaga: Inkubacja w komorze wilgotnościowej zapobiega odparowywaniu pożywki z dołków na krawędziach płytek, zapewniając jednorodne środowisko dla wszystkich dołków.
10. Wyczyścić robota qFill3, najpierw przepłukując go wodą (~50mL), a następnie 80% etanolem (~50mL). Rozłożyć komponenty, a następnie wyczyścić i autoklawować butelkę, nakrętkę oraz przewody zawinięte w folię aluminiową.

2. Pomiar wzrostu klonów E. coli

1. Wyjmij płytki z inkubatora 37°C. Zdejmij i odłóż pokrywki, a następnie umieść płytki na platformie załadunkowej magazynka dołączonej do urządzenia RapidStak (maksymalnie 25 płytek).
   Uwaga: Płytka na spodzie stosu zostanie odczytana jako pierwsza. Należy pamiętać o kolejności płytek, ponieważ oprogramowanie jej nie rejestruje.
2. Wyjmij jeden magazynek z RapidStak, upewnij się, że jest pusty, i nasuń go na stos płytek przeznaczonych do odczytu. Chwyć go za uchwyt; wszystkie płytki powinny zostać załadowane do magazynka. Wsuń magazynek do RapidStak.
   Uwaga: Magazynek posiada w rogu małą śrubkę, która wskazuje, w którym rogu powinny znajdować się studzienki A1 płytek. Magazynek można zamontować w RapidStak tylko w jednej orientacji.
3. Uruchom program SkanIt RE na komputerze podłączonym do urządzeń. Wybierz „New Session” i nazwij ją w odpowiedni sposób. Jako typ płytki wybierz „Corning Flat Bottom 384-well plate”.
4. W sekcji „Plate Layout” kliknij przycisk „Wizard” i wybierz go, aby dodać 384 próbki nieznane do swojej płytki.
5. W sekcji „Protocol” wybierz opcję „Well Loop” i wprowadź wartość dla 384 studzienek. Po lewej stronie ekranu w schemacie przepływu pojawi się ikona „Well Loop”. Wybierz tę ikonę i kliknij, aby dodać „Photometric Measurement”. Ustaw odczyt na 60nm.
6. Zapisz protokół pod unikalną nazwą i zamknij program SkanIt RE.
7. Otwórz program PolaraRS na komputerze.
8. Na stronie głównej znajduje się tabela z listą instrumentów podłączonych do urządzenia RapidStak. VarioSkan powinien znajdować się po lewej stronie tej tabeli. Pod nagłówkiem VarioSkan znajdują się dwa łącza: „RunSession” oraz „Incubate”. Kliknij opcję „RunSession”.
9. Pojawi się nowe okno testu z schematem blokowym w środku. Wybierz element „RunSession” (powinien być to jedyny dostępny element). Po prawej stronie ekranu pojawi się menu rozwijane. Znajdź w tym menu nazwę zapisanego uruchomienia w SkanIt RE.
   Uwaga: Menu to nie wydaje się mieć logicznej kolejności. Nie jest ono ułożone alfabetycznie, chronologicznie ani według miejsca zapisu protokołu na komputerze. Oznacza to konieczność przejrzenia wszystkich protokołów w celu znalezienia własnego, co jest uciążliwe.
10. Po wybraniu protokołu kliknij w prawym górnym rogu „Run this assay”.
11. Pojawi się okno z prośbą o wskazanie, który magazynek ma służyć jako źródło, a który jest pusty. Dolne pole na ekranie odpowiada przedniemu magazynkowi. [Opcjonalnie: Program prosi o wprowadzenie liczby załadowanych płytek w celu oszacowania czasu trwania procesu. Szacunek ten zazwyczaj jest bardzo niedokładny].
12. Upewnij się, że zarówno RapidStak, jak i VarioSkan są włączone, a następnie naciśnij „OK”.
13. RapidStak automatycznie załaduje płytki do czytnika, umożliwiając ciągłe pomiary. Odczyt 25 płytek trwa około 50 minut.
    Uwaga: Zaleca się obserwację załadowania pierwszej płytki do VarioSkan, aby upewnić się, że urządzenia są prawidłowo wyrównane. Jeśli RapidStak nie załaduje prawidłowo czytnika płytek, użyj przycisku „Pause this assay” w prawym górnym rogu okna PolaraRS.
14. Po zakończeniu odczytu wszystkich płytek przez VarioSkan wyjmij pełny magazynek i umieść go na platformie załadunkowej. Podnieś zewnętrzny prostokąt platformy; magazynek powinien wysunąć się, pozostawiając płytki w stosie na środku. Nałóż pokrywki na odpowiednie płytki.

3. Dodanie mieszaniny pomiarowej do każdej płytki

1. Przygotować mieszaninę do analizy, używając gotowego 10-krotnego roztworu zapasu mieszaniny lizującej (10% Triton X-10, 100mM ris, 10mM EDTA) w 50mM buforze octanu potasu o pH 5.5. Przygotować roztwór zapasu substratu DNP-celobiosydu o stężeniu do 75mg/mL w DMSO, upewniając się, że substrat jest całkowicie rozpuszczony. Dodać roztwór zapasu DNP-celobiosydu do mieszaniny do analizy do końcowego stężenia 0.1mg/mL. Każda płytka będzie wymagać około 20mL roztworu, plus dodatkowe 50mL, aby uwzględnić objętość martwą.
   Uwaga: DNP-celobiosyd nie rozpuszcza się łatwo w wodzie, dlatego rozpuszczenie w DMSO zwiększa jego rozpuszczalność. Obecność DMSO w końcowym roztworze do analizy nie wywołuje obserwowalnych efektów.
2. Przygotować urządzenie qFill3 zgodnie z instrukcjami producenta, podłączając butelkę z medium do rozdzielacza za pomocą sterylnego drenu. Zaprogramować urządzenie na odpowiednią ilość medium i ustawić napełnianie objętości 45uL w każdej studni.
3. Usunąć powietrze z drenu i rozdzielacza, korzystając z funkcji purge robota, aż medium będzie widoczne przy każdym pinie rozdzielacza.
4. Dodać mieszaninę do analizy do każdej płytki za pomocą qFill3. Napełnienie każdej płytki zajmuje około 20 sekund.
5. Po dodaniu mieszaniny do analizy inkubować płytki w 37°C w komorze wilgotności przez 12-16 godzin.
   Uwaga: Zbyt długa inkubacja płytek po dodaniu mieszaniny do analizy spowoduje odparowanie w zewnętrznych studniach płytki, co doprowadzi do uzyskania wyższych odczytów absorbancji niż w studniach wewnętrznych. Można temu zapobiec, inkubując płytki w komorze wilgotności.

4. Pomiar absorbancji analizowanych klonów

1. Wyjmij płytki z inkubatora 37°C. Zdejmij i odłóż pokrywki, a następnie umieść płytki na platformie załadowczej magazynka dołączonej do urządzenia RapidStak, maksymalnie do 25 płytek.
   Uwaga: Płytka na dole stosu zostanie odczytana jako pierwsza. Należy kontrolować kolejność płytek, ponieważ oprogramowanie nie zapisuje tych informacji.
2. Wyjmij jeden magazynek z RapidStak, upewnij się, że jest pusty, i nasuń go na stos płytek do odczytu. Chwyć go za uchwyt, aby wszystkie płytki zostały załadowane do magazynka. Włóż magazynek do RapidStak.
   Uwaga: Magazynek posiada małą śrubę w narożniku, która wskazuje, w którym rogu powinny znajdować się studzienki A1 płytek. Magazynek można zamontować w RapidStak tylko w jednej orientacji.
3. Uruchom program SkanIt RE na komputerze podłączonym do urządzeń. Wybierz „New Session” i nazwij ją odpowiednio. Jako typ płytki wybierz „Corning Flat Bottom 384-well plate”.
4. W obszarze „Plate Layout” wybierz przycisk „Wizard” i użyj go, aby dodać 384 próbki nieznane do płytki.
5. W obszarze „Protocol” wybierz opcję „Well Loop” i wprowadź wartość dla 384 studzienek. Ikona „Well Loop” pojawi się w schemacie przepływu po lewej stronie ekranu. Wybierz tę ikonę i kliknij, aby dodać „Photometric Measurement”. Ustaw odczyt na 400nm.
6. Zapisz protokół pod unikalną nazwą i zamknij program SkanIt RE.
7. Na komputerze otwórz program PolaraRS.
8. Na stronie głównej znajdzie się tabela z listą instrumentów podłączonych do urządzenia RapidStak. VarioSkan powinien znajdować się w lewej części tej tabeli. Pod nagłówkiem VarioSkan widoczne będą dwa łącza: „RunSession” oraz „Incubate”. Kliknij opcję „RunSession”.
9. Pojawi się nowe okno (okno analizy) ze schematem blokowym w środku. Wybierz element „RunSession” (powinien to być jedyny obecny element). Po prawej stronie ekranu pojawi się menu rozwijane. Znajdź w tym menu nazwę zapisanego pomiaru w SkanIt RE.
10. Po wybraniu protokołu kliknij w prawym górnym rogu „Run this assay”.
11. Pojawi się okno z prośbą o wskazanie, który magazynek ma służyć jako źródłowy, a który jest pusty. Dolne pole na ekranie odpowiada przedniemu magazynkowi. [Opcjonalnie: Program prosi o wprowadzenie liczby załadowanych płytek w celu oszacowania czasu trwania procesu. Szacunek ten jest zazwyczaj bardzo niedokładny.]
12. Upewnij się, że zarówno RapidStak, jak i VarioSkan są włączone, a następnie naciśnij „OK”.
13. RapidStak automatycznie załaduje płytki do czytnika płytek, umożliwiając ciągłe pomiary.
    Uwaga: Zaleca się obserwację ładowania pierwszej płytki do VarioSkan, aby upewnić się, że urządzenia są prawidłowo wyrównane. Jeśli RapidStak nie załaduje prawidłowo czytnika płytek, użyj przycisku „Pause this assay” w prawym górnym rogu okna PolaraRS.
14. Po zakończeniu odczytu wszystkich płytek przez VarioSkan, wyjmij pełny magazynek i umieść go na platformie załadowczej. Podnieś zewnętrzny prostokąt platformy; magazynek powinien zsunąć się, pozostawiając płytki w stosie na środku. Płytki można zutylizować zgodnie z procedurami laboratoryjnymi.
15. Aby wyeksportować odczyty absorbancji, otwórz oprogramowanie SkanIt RE i wybierz „Open an existing file”.
16. Wybierz katalog, w którym zapisano sesję, kliknij ikonę „+”, aby rozwinąć listę; pod nagłówkiem tytułu znajdą się opcje od „Container 1” do „Container N” w zależności od liczby płytek. Wybierz pierwszą płytkę do analizy.
17. W pasku menu na górze strony wybierz „Data Processing > Report/Export”.
18. Wybierz opcje pożądane do eksportu.
    Uwaga: Zazwyczaj do eksportu wybieram dane „Plate Layout” oraz „Photometric”.
19. Kliknij „View Report”, a następnie „File > Save”. Wybierz żądany katalog. Format wyjściowy to arkusz programu Microsoft Excel.

5. Reprezentatywne wyniki

Przykład pomiarów absorbancji z pojedynczej płytki 384-dołkowej zawierającej klon pozytywny przedstawiono na Rysunku 2. Klony pozytywne wykazują wyraźny wzrost absorbancji w porównaniu do tych, które nie wykazują aktywności celulazy. Różnice w czasie trwania analizy, położeniu dołka na płytce lub stężeniu DNP (które może wynikać z odfiltrowania nierozpuszczonego DNP) mogą wpływać na bezwzględne odczyty absorbancji. Względne pomiary absorbancji, takie jak różnica w absorbancji względem średniej dla całej płytki lub średniej dla kolumny, stanowią bardziej wiarygodną metodę identyfikacji klonów pozytywnych pod kątem aktywności celulazy.

Po zidentyfikowaniu pozytywnych klonów na płytkach bibliotecznych zaleca się przeniesienie wszystkich pozytywnych klonów na nową płytkę w celu przeprowadzenia drugiego etapu przesiewowego. Pozwala to wyeliminować efekty wynikające z położenia studni lub zmienności płytek oraz umożliwia bardziej bezpośrednie porównanie pozytywnych klonów.

Rycina 1. Schemat wysokoprzepustowego testu dla biblioteki metagenomicznej sklonowanej do E. coli i przechowywano w temperaturze -80°C.

Rycina 2. Odczyty absorbancji z jednej płytki 384-dołkowej zawierającej klon pozytywny. Klony pozytywne pod kątem aktywności celulazy można zidentyfikować po znacznie wyższej absorbancji w porównaniu do klonów negatywnych.

Dyskusja

W niniejszym protokole opisano wysokoprzepustowy skrining służący do szybkiej detekcji aktywności celulolitycznej z metagenomicznej biblioteki DNA genomowego z dużymi insertami, eksprymowanej w E. coli. Metoda ta stanowi udoskonalenie testu CMC/Congo Red powszechnie stosowanego w literaturze. Jest to metoda oparta na roztworach, umożliwiająca prowadzenie skriningu chemicznego w jednym naczyniu (one-pot) w płytkach 384-dołkowych, w której końcowym wynikiem są odczyty absorbancji z czytnika płytek, co pozwala na a...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
qPix2	Genetix		Z głowicą do siatkowania 384-pinową
qFill3	Genetix		Z kolektorem 384-dołkowym
Varioskan	Thermo Fisher Scientific, Inc.
RapidStak	Thermo Fisher Scientific, Inc.		Połączony z Varioskan
Detergent Micro90	Cole-Parmer	18100-00	Rozcieńczony do 2% w wodzie
Etanol	Major Lab Supplier		Rozcieńczony do 80% w wodzie
Chloramfenikol	Sigma-Aldrich	C0378	12.5mg/mL w etanolu
Pożywka LB, Miller	Fisher Scientific	BP1426-2	25g/L, autoklawowana
Płytki 384-dołkowe z płaskim dnem	Corning	3680
L-(+)-Arabinoza	Sigma-Aldrich	A3256	100mg/mL w wodzie
Octan potasu	Fisher Scientific	P171	50mM w wodzie, autoklawowany, pH skorygowane do pH 5.5 za pomocą HCl
Triton X-100	Fisher Scientific	BP151
Chlorowodorek Trizmy	Sigma-Aldrich	T3253	W roztworze buforu TE, 100mM
Sól disodowa EDTA	Sigma-Aldrich	E5134	W roztworze buforu TE, 10mM
2,4-dinitrofenylo-celobiozyd			Dostarczony przez dr. Steve'a Withersa, UBC
Dimetylosulfoksyd	Sigma-Aldrich	D8418