Wysokoprzepustowe badanie przesiewowe aktywności celulazy biogórniczej z bibliotek metagenomicznych

Podsumowanie

Ten protokół opisuje wysokoprzepustowe badanie przesiewowe aktywności celulolitycznej z biblioteki metagenomicznej wyrażonej w Escherichia coli. Sito jest oparte na roztworze i wysoce zautomatyzowane i wykorzystuje jednogarnkową chemię w 384 mikropłytkach dołkowych, a końcowy odczyt jest pomiarem absorbancji.

Streszczenie

Celuloza, najobfitsze źródło węgla organicznego na planecie, ma szeroki zakres zastosowań przemysłowych, z rosnącym naciskiem na produkcję biopaliw ¹. Chemiczne metody modyfikacji lub degradacji celulozy zazwyczaj wymagają silnych kwasów i wysokich temperatur. W związku z tym metody enzymatyczne stały się znaczące w procesie biokonwersji. Podczas gdy identyfikacja aktywnych celulaz z izolatów bakteryjnych i grzybowych była dość skuteczna, zdecydowana większość drobnoustrojów w naturze jest odporna na hodowlę laboratoryjną. Genomika środowiskowa, znana również jako metagenomika, metody badań przesiewowych są bardzo obiecujące, jeśli chodzi o wypełnienie luki w uprawie w poszukiwaniu nowych enzymów biokonwersji. Metagenomiczne metody badań przesiewowych z powodzeniem pozwoliły odzyskać nowe celulazy ze środowisk tak różnych, jak gleby ², żwacz bawoła ³ i tylne jelito termitów ⁴ przy użyciu płytek agarowych karboksymetylocelulozy (CMC) barwionych czerwonym barwnikiem Kongo (w oparciu o metodę Teather i Wood ⁵). Jednak metoda CMC ma ograniczoną przepustowość, nie jest ilościowa i charakteryzuje się niskim stosunkiem sygnału do szumu ⁶. Inne metody zostały zgłoszone ^7,8, ale każda z nich wykorzystuje test na płytce agarowej, co jest niepożądane w przypadku wysokoprzepustowych badań przesiewowych dużych bibliotek genomowych. W tym miejscu przedstawiamy oparte na roztworze badanie przesiewowe aktywności celulazy przy użyciu chromogennego substratu dinitrofenolu (DNP)-celobiozydu ⁹. Nasza biblioteka została sklonowana do fosmidu kontrolnego pCC1 w celu zwiększenia czułości testu poprzez indukcję liczby kopii ¹⁰. Metoda wykorzystuje jednomiskową chemię w 384-dołkowych mikropłytkach, a końcowy odczyt zapewnia się jako pomiar absorbancji. Odczyt ten jest ilościowy, czuły i zautomatyzowany z przepustowością do 100 płytek 384-dołkowych dziennie przy użyciu płynnego urządzenia do obsługi i czytnika płytek z dołączonym systemem układania w stosy.

Protokół

Zanim uruchomisz ten protokół, będziesz potrzebował swojej biblioteki metagenomicznej przechowywanej w formacie płytki 384-dołkowej. W naszym badaniu użyliśmy wektora fosmidowego pCC1 kontrolnego w połączeniu z odpornymi na fagi T1 komórkami TransforMax EPI300-T1^R E. coli jako hosta biblioteki i przechowywaliśmy nasze płytki w temperaturze -80 °C ¹¹.

1. Replikacja płytek biblioteki metagenomicznej

1. Rozmrażaj talerze zawierające bibliotekę w temperaturze 37°C przez około 20 minut lub do momentu, gdy wszystkie studzienki zostaną rozmrożone.
2. Użyj funkcji sterylizacji światłem UV w qPix2, aby sterylizować robota przez 15 minut.
3. Przygotuj bulion LB z chloramfenikolem o końcowym stężeniu 12,5 ug / ml i arabinozą o stężeniu 100 ug / ml w butelce z odczynnikiem o pojemności 500 ml. Każda płytka zużyje około 20 ml plus dodatkowe 50 ml, aby umożliwić uzyskanie martwej objętości.
4. Ustaw qFill3 zgodnie z instrukcjami producenta z butelką z pożywką podłączoną do kolektora za pomocą sterylnego przewodnika. Zaprogramuj go na odpowiednią ilość pożywki i ustaw go tak, aby wypełniał objętość 45 μl w każdym dołku.
5. Usuń powietrze z przewodu i kolektora za pomocą funkcji przedmuchiwania robota, aż media będą widoczne z każdego sworznia kolektora.
6. Napełnij żądaną liczbę płytek nośnikiem LB za pomocą qFill3. Napełnienie każdej płytki zajmuje około 20 sekund.
7. Załaduj płyty biblioteczne i świeże płyty do odpowiednich obszarów robota qPix2. Napełnić kąpiele czyszczące odpowiednimi odczynnikami; 2% Micro90 w kąpieli tylnej, autoklawizowana woda destylowana w kąpieli środkowej, 80% etanolu w kąpieli przedniej.
8. Użyj programu "Replikacja" qPix2. W oprogramowaniu należy wybrać odpowiednią głowicę, liczbę i typy płyt źródłowych oraz tabliczek docelowych. Ustaw również głowicę do czyszczenia między powtórzeniami, zwykle wystarczy 6 cykli w każdej kąpieli. Pojemność maszyny wynosi 10 płytek na raz, a odtworzenie ich wszystkich za pomocą głowicy 384-pinowej zajmuje około 15 minut (lub około 50 minut z głowicą 96-pinową).
   Uwaga: Istnieje opcja "Mieszaj źródło" lub "Miejsce docelowe mieszania". Zaleca się, aby nie korzystać z tych opcji, ponieważ wcześniej wystąpiły problemy z korzystaniem z nich przez naszego robota.
9. Po powtórzeniu płytek hoduj je w temperaturze 37°C przez 24 godziny w pojemniku nawilżającym. Ponieważ indukujemy wysoką liczbę kopii fosmidu z dodatkiem arabinozy, klony mają tendencję do wolniejszego wzrostu niż klony nieindukowane. Przywróć tabliczki biblioteczne do -80°C.
   Uwaga: Inkubacja w komorze wilgotnościowej zapewnia, że parowanie mediów nie następuje w studzienkach na krawędzi płyt, utrzymując jednolite środowisko dla wszystkich studzienek.
10. Wyczyść robota qFill3, najpierw przepłukując go wodą (~50 ml), a następnie 80% etanolem (~50 ml). Zdemontuj elementy, a następnie wyczyść i autoklawuj butelkę, pokrywkę i rurkę owinięte folią aluminiową.

2. Pomiar wzrostu klonów E. coli

1. Wyjąć płytki z inkubatora w temperaturze 37°C. Zdejmij i odłóż pokrywy na bok, a następnie umieść talerze na platformie ładującej magazynek dostarczonej z RapidStak, maksymalnie do 25 talerzy.
   Uwaga: Tabliczka na dole stosu będzie pierwszą, która zostanie odczytana. Upewnij się, że śledzisz kolejność płyt, ponieważ oprogramowanie tego nie rejestruje.
2. Wyjmij jeden magazynek z Rapid Stak, upewnij się, że jest pusty i wepchnij go na stos płyt do odczytu. Chwyć go za uchwyt, a wszystkie talerze powinny zostać załadowane do magazynka. Załaduj magazynek do RapidStak.
   Uwaga: Magazynek ma małą w rogu, która wskazuje, w którym rogu powinny znajdować się dołki A1 płyt. Magazynek będzie montowany w RapidStak tylko w jednej orientacji.
3. Otwórz program SkanIt RE na komputerze podłączonym do maszyn. Wybierz "Nowa sesja" i nazwij ją odpowiednio. Jako typ płytki wybierz "Corning Flat Bottom 384-well plate".
4. W obszarze "Układ płyty" wybierz przycisk "Kreator" i wybierz go, aby dodać 384 niewiadome do swojej tabliczki.
5. W obszarze "Protokół" wybierz opcję "Pętla studni" i wprowadź dla 384 dołków. Ikona "Pętli studni" pojawi się w drzewie przepływu po lewej stronie ekranu. Wybierz ikonę i kliknij, aby dodać "Pomiar fotometryczny". Ustaw go na odczyt przy 600 nm.
6. Zapisz swój protokół o unikalnej nazwie i zamknij program SkanIt RE.
7. Na komputerze otwórz program PolaraRS.
8. Na stronie głównej znajdzie się tabela z listą instrumentów podłączonych do urządzenia RapidStak. VarioSkan powinien znajdować się po lewej stronie tej tabeli. Pod nagłówkiem VarioSkan znajdą się dwa linki; "RunSession" i "Inkubuj". Kliknij opcję "RunSession".
9. Pojawi się nowe okno, okno testu, ze schematem blokowym pośrodku. Wybierz element "RunSession" (powinien to być jedyny obecny element). Po prawej stronie ekranu pojawi się menu rozwijane. Znajdź nazwę zapisanego uruchomienia SkanIt RE w tym menu.
   Uwaga: Wygląda na to, że nie ma racjonalnej kolejności w tym menu. Nie jest on ułożony alfabetycznie, według daty dodania ani nie jest powiązany z miejscem na komputerze, w którym protokół został zapisany. Oznacza to, że musisz przejrzeć wszystkie protokoły, zanim znajdziesz własny, co jest uciążliwe.
10. Po wybraniu protokołu w prawym górnym rogu kliknij "Uruchom ten test".
11. Pojawi się okno z prośbą o wskazanie, który magazynek ma być używany jako źródło i który magazynek jest pusty. Dolne pudełko na ekranie odpowiada przedniemu magazynkowi. [Opcjonalnie: Prosi o podanie liczby załadowanych płyt w celu określenia szacunkowego czasu, jaki to zajmie. To oszacowanie jest zwykle dalekie od prawdy.]
12. Upewnij się, że zarówno RapidStak, jak i VarioSkan są włączone, a następnie naciśnij "OK".
13. RapidStak automatycznie załaduje Twoje płytki do czytnika płytek, co pozwoli na ciągłe pomiary płytek. Odczyt 25 tabliczek zajmuje około 50 minut.
    Uwaga: Zaleca się obserwację pierwszego ładowania płyty do VarioSkan, aby zapewnić prawidłowe ustawienie maszyn. Jeśli RapidStak nie załaduje prawidłowo czytnika płytek, użyj przycisku "Wstrzymaj ten test" w prawym górnym rogu okna PolaraRS.
14. Gdy VarioSkan zakończy odczytywanie wszystkich płyt, wyjmij pełny magazynek i umieść go na platformie załadowczej magazynu. Podnieś zewnętrzny prostokąt platformy, a magazynek powinien się zsunąć, pozostawiając talerze stojące w stosie pośrodku. Załóż pokrywki na odpowiednie talerze.

3. Dodawanie mieszanki testowej do każdej płytki

1. Przygotuj mieszaninę testową, używając wstępnie przygotowanych 10 ml mieszanki do lizy (10% Triton X-100, 100mM ris, 10mM EDTA) w 50mM buforze octanu potasu o pH 5,5. Przygotuj zapas do 75 mg/ml substratu DNP-cellobioside w DMSO, upewniając się, że substrat jest całkowicie rozpuszczony. Dodać roztwór podstawowy DNP-cellobioside do mieszanki testowej do końcowego stężenia 0,1 mg/ml. Każda płytka zużyje około 20 ml roztworu, plus dodatkowe 50 ml, aby umożliwić uzyskanie martwej objętości.
   Uwaga: DNP-Cellobioside nie jest łatwo rozpuszczalny w wodzie, więc rozpuszczenie w DMSO zwiększa rozpuszczalność. Obecność DMSO w końcowym roztworze testowym nie ma obserwowalnych skutków.
2. Ustaw qFill3 zgodnie z instrukcjami producenta z butelką z pożywką podłączoną do kolektora za pomocą sterylnego przewodnika. Zaprogramuj go na odpowiednią ilość pożywki i ustaw go tak, aby wypełniał objętość 45 μl w każdym dołku.
3. Usuń powietrze z przewodu i kolektora za pomocą funkcji przedmuchiwania robota, aż media będą widoczne z każdego sworznia kolektora.
4. Dodaj mieszaninę testową do każdej płytki za pomocą qFill3. Napełnienie każdej płytki zajmuje około 20 sekund.
5. Po dodaniu mieszaniny testowej inkubować płytki w temperaturze 37°C w komorze wilgotnościowej przez 12-16 godzin.
   Uwaga: Nadmierna inkubacja płytek po dodaniu mieszanki testowej spowoduje parowanie w zewnętrznych dołkach płytki, dając wyższe odczyty absorbancji niż obserwowane w studzienkach wewnętrznych. Można to zniwelować poprzez inkubację płytek w komorze wilgotnościowej.

4. Odczyt absorbancji testowanych klonów

1. Wyjąć płytki z inkubatora w temperaturze 37°C. Zdejmij i odłóż pokrywy na bok, a następnie umieść talerze na platformie ładującej magazynek dostarczonej z RapidStak, maksymalnie do 25 talerzy.
   Uwaga: Tabliczka na dole stosu będzie pierwszą, która zostanie odczytana. Upewnij się, że śledzisz kolejność płyt, ponieważ oprogramowanie tego nie rejestruje.
2. Wyjmij jeden magazynek z Rapid Stak, upewnij się, że jest pusty i wepchnij go na stos płyt do odczytu. Chwyć go za uchwyt, a wszystkie talerze powinny zostać załadowane do magazynka. Załaduj magazynek do RapidStak.
   Uwaga: Magazynek ma małą w rogu, która wskazuje, w którym rogu powinny znajdować się dołki A1 płyt. Magazynek będzie montowany w RapidStak tylko w jednej orientacji.
3. Otwórz program SkanIt RE na komputerze podłączonym do maszyn. Wybierz "Nowa sesja" i nazwij ją odpowiednio. Jako typ płytki wybierz "Corning Flat Bottom 384-well plate".
4. W obszarze "Układ płyty" wybierz przycisk "Kreator" i wybierz go, aby dodać 384 niewiadome do swojej tabliczki.
5. W obszarze "Protokół" wybierz opcję "Pętla studni" i wprowadź dla 384 dołków. Ikona "Pętli studni" pojawi się w drzewie przepływu po lewej stronie ekranu. Wybierz ikonę i kliknij, aby dodać "Pomiar fotometryczny". Ustaw go na odczyt przy 400 nm.
6. Zapisz swój protokół o unikalnej nazwie i zamknij program SkanIt RE.
7. Na komputerze otwórz program PolaraRS.
8. Na stronie głównej znajdzie się tabela z listą instrumentów podłączonych do urządzenia RapidStak. VarioSkan powinien znajdować się po lewej stronie tej tabeli. Pod nagłówkiem VarioSkan znajdą się dwa linki; "RunSession" i "Inkubuj". Kliknij opcję "RunSession".
9. Pojawi się nowe okno, okno testu, ze schematem blokowym pośrodku. Wybierz element "RunSession" (powinien to być jedyny obecny element). Po prawej stronie ekranu pojawi się menu rozwijane. Znajdź nazwę zapisanego przebiegu SkanIt RE w tym menu.
10. Po wybraniu protokołu w prawym górnym rogu kliknij "Uruchom ten test".
11. Pojawi się okno z prośbą o wskazanie, który magazynek ma być używany jako źródło i który magazynek jest pusty. Dolne pudełko na ekranie odpowiada przedniemu magazynkowi. [Opcjonalnie: Prosi o podanie liczby załadowanych płyt w celu określenia szacunkowego czasu, jaki to zajmie. To oszacowanie jest zwykle dalekie od prawdy.]
12. Upewnij się, że zarówno RapidStak, jak i VarioSkan są włączone, a następnie naciśnij "OK"
13. RapidStak automatycznie załaduje płytki do czytnika płytek, co pozwoli na ciągłe pomiary płyt.
    Uwaga: Zaleca się obserwację pierwszego ładowania płyt do VarioSkan, aby zapewnić prawidłowe ustawienie maszyn. Jeśli RapidStak nie załaduje prawidłowo czytnika płytek, użyj przycisku "Wstrzymaj ten test" w prawym górnym rogu okna PolaraRS.
14. Gdy VarioSkan zakończy odczytywanie wszystkich płyt, wyjmij pełny magazynek i umieść go na platformie załadowczej magazynu. Podnieś zewnętrzny prostokąt platformy, a magazynek powinien się zsunąć, pozostawiając talerze stojące w stosie pośrodku. Płytki można zutylizować zgodnie z procedurami laboratoryjnymi.
15. Aby wyeksportować odczyty absorbancji, otwórz oprogramowanie SkanIt RE i wybierz opcję "Otwórz istniejący plik".
16. Wybierz katalog, w którym zapisałeś sesję, kliknij ikonę "+", aby rozwinąć listę, a pod nagłówkiem tytułu pojawią się opcje oznaczone "Kontener 1" do "Kontener N" w zależności od liczby tablic. Wybierz pierwszą blachę, która ma zostać poddana analizie.
17. Na pasku menu u góry strony wybierz "Przetwarzanie danych > raport/eksport"
18. Wybierz opcje żądane do eksportu.
    Uwaga: Zazwyczaj wybieram "Układ płyty" i "Fotometryczne" dane do eksportu.
19. Kliknij "Wyświetl raport", a następnie "Plik > zapisz". Wybierz żądany katalog. Formatem wyjściowym jest arkusz kalkulacyjny Microsoft Excel

5. Reprezentatywne wyniki

Przykład odczytów absorbancji z pojedynczej płytki 384-dołkowej zawierającej dodatni klon jest pokazany na rysunku 2. Dodatnie klony wykazują wyraźny wzrost absorbancji w porównaniu z tymi, które nie wyrażają aktywności celulazy. Różnice w czasie testu, lokalizacji studzienki na płytce lub stężeniu DNP (mogą być wprowadzone przez odfiltrowanie nierozpuszczonego DNP) mogą wpływać na bezwzględne odczyty absorbancji. Odczyty absorbancji względnej, takie jak różnica w absorbancji powyżej średniej płytowej lub średniej kolumnowej, są bardziej wiarygodną metodą identyfikacji klonów dodatnich pod względem celulazy.

Po zidentyfikowaniu pozytywnych klonów z płyt bibliotecznych, zaleca się replikację wszystkich pozytywnych klonów na nową płytę w celu wtórnego przebadania. Eliminuje to efekty wynikające z lokalizacji studni lub zmienności płytki i pozwala na bardziej bezpośrednie porównanie między dodatnimi klonami.

Rysunek 1. Schemat blokowy wysokoprzepustowego testu dla biblioteki metagenomicznej sklonowanej do E. coli i przechowywanej w temperaturze -80°C.

Rysunek 2. Odczyty absorbancji z jednej płytki 384-dołkowej zawierającej dodatni klon. Klony dodatnie pod względem celulazy można rozpoznać po znacznie zwiększonej absorbancji w porównaniu z klonami ujemnymi.

Dyskusja

W niniejszym protokole opisano wysokoprzepustowe badanie przesiewowe do szybkiego wykrywania aktywności celulolitycznej z dużej biblioteki metagenomicznej DNA genomowego wyrażanego w E. coli . Metoda ta stanowi ulepszenie w stosunku do testu CMC/Congo Red powszechnie stosowanego w literaturze. Jest oparty na roztworze i pozwala na jednogarnkowe badania przesiewowe chemiczne na płytkach 384-dołkowych, z końcowym wynikiem w postaci odczytów absorbancji z czytnika płytek umożliwiających analizę ilościową. Automatyz...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
qPix2	Genetix		Z 384-pinową głowicą siatkową
qFill3	Genetix		Z 384-dołkowym kolektorem
Varioskan	Thermo Fisher Scientific, Inc.
RapidStak	Thermo Fisher Scientific, Inc.		Połączony z Varioskan
Micro90 Detergent	Cole-Parmer	18100-00	Rozcieńczony do 2% w wodzie
Etanol	Główny dostawca		Rozcieńczony do 80% w wodzie
Chloramfenikol	Sigma-Aldrich	C0378	12,5 mg / ml w
bulionie etanolowym LB, Miller	Fisher Scientific	BP1426-2	25 g / L, autoklawowany
384-dołkowe płaskie płytki	denne Corning	3680
L-(+)-Arabinose	Sigma-Aldrich	A3256	100mg/mL w wodzie
Octan potasu	Fisher Scientific	P171	50mM w wodzie, autoklawowane, dostosowane do pH 5,5 z HCl
Triton X-100	Fisher Scientific	BP151
Chlorowodorek Trizma	Sigma-Aldrich	T3253	W roztworze buforowym TE, 100mM
sól disodowa EDTA	Sigma-Aldrich	E5134	W roztworze buforowym TE, 10mM
2,4-dinitrofenyl celobiozyd			Dostarczone przez dr Steve'a Withersa, UBC
Dimethyl Sulfoxide	Sigma-Aldrich	D8418