Artykuł metodologiczny

Ostry zawał mięśnia sercowego u szczurów

54.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/2464

⸱

16 lutego 2011

 ,  ,  ,  , 
1Department of Internal Medicine, Division of Cardiology, University of Texas Medical Branch, 2Department of Pharmacological and Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy, University of Houston (UH), Texas Medical Center

W tym artykule

Podsumowanie

Szczurzy model ostrego zawału mięśnia sercowego (AMI) jest przydatny do badania skutków zawału dla patofizjologicznych i fizjologicznych funkcji serca.

Streszczenie

W obliczu faktu, że niewydolność serca jest główną przyczyną zgonów w USA (Hunt), badania biomedyczne mają fundamentalne znaczenie dla rozwoju metod leczenia chorób układu sercowo-naczyniowego. Modele zwierzęce naśladujące ludzkie choroby serca, takie jak zawał mięśnia sercowego (MI) i niedokrwienie-reperfuzja (IR) wywołujące niewydolność serca, a także przeciążenie ciśnieniowe (poprzeczne zwężenie aorty) indukujące przerost serca i niewydolność serca (Goldman and Tarnavski), stanowią przydatne modele do badania chorób sercowo-naczyniowych. W szczególności niedokrwienie mięśnia sercowego (MI) jest główną przyczyną zachorowalności i śmiertelności sercowo-naczyniowej, pomimo kontrolowania niektórych czynników ryzyka, takich jak tętnicowstępność, oraz stosowania interwencji chirurgicznych (Thygesen). Co więcej, ostra utrata mięśnia sercowego w następstwie niedokrwienia mięśnia sercowego (MI) prowadzi do zwiększenia obciążenia, co indukuje remodeling komory brzusznej w strefie przyzawałowej oraz w odległych obszarach nieobjętych zawałem. Apoptoza i nekroza miocytów oraz wynikający z nich zwiększony ładunek hemodynamiczny aktywują liczne wewnątrzkomórkowe szlaki sygnalizacyjne, które inicjują rozszerzenie LV, przerost, deformację kształtu komory oraz tworzenie blizny kolagenowej. Ten patologiczny remodeling i brak normalizacji zwiększonych naprężeń ściany prowadzą do postępującego rozszerzenia, włączania mięśnia sercowego ze strefy przyzawałowej do blizny, a ostatecznie do pogorszenia kurczliwości mięśnia sercowego (tj. niewydolności serca). Postęp dysfunkcji LV i niewydolności serca u szczurów jest podobny do tego, który obserwuje się u pacjentów przeżywających rozległy zawał mięśnia sercowego, u których następnie rozwija się niewydolność serca (Goldman). Model ostrego zawału mięśnia sercowego (AMI) u szczurów jest wykorzystywany do naśladowania ludzkich chorób sercowo-naczyniowych; konkretnie do badania mechanizmów sygnalizacji kardiologicznej związanych z niewydolnością serca, a także do oceny skuteczności strategii terapeutycznych w leczeniu niewydolności serca. Metoda opisana w niniejszym raporcie to szczurzy model ostrego zawału mięśnia sercowego (AMI). Model ten nazywany jest również ostrą kardiomiopatią niedokrwienną lub niedokrwieniem z następującą reperfuzją (IR); jest on indukowany 30-minutowym okresem ostrego niedokrwienia poprzez podwiązanie lewej przedniej tętnicy zstępującej (LAD), a następnie reperfuzją tkanki po zwolnieniu podwiązania LAD (Vasilyev and McConnell). Niniejszy protokół koncentruje się na ocenie wielkości zawału oraz obszaru zagrożonego (AAR) przy użyciu barwnika błękitu Evansa i chlorku trifenylotetrazolium (TTC) po 4 godzinach reperfuzji; przedstawiono również dodatkowe uwagi dotyczące oceny funkcji serca i remodelingu poprzez modyfikację czasu trwania reperfuzji. Ogólnie rzecz biorąc, ten zwierzęcy model AMI u szczurów jest przydatny do badania następstw zawału mięśnia sercowego w zakresie patofizjologicznych i fizjologicznych funkcji serca.

Protokół

1. Przygotowanie obszaru operacyjnego

  1. Powierzchnię roboczą należy najpierw przygotować, dezynfekując obszar 70% etanolem.
  2. Wszystkie instrumenty chirurgiczne muszą zostać wysterylizowane w sterylizatorze koralikowym przed operacją (a także pomiędzy poszczególnymi operacjami na szczurach). Instrumenty te obejmują: nożyczki chirurgiczne (2), pęsetę (1), pęsetę zakrzywioną (1), uchwyt igłowy (2) oraz rozieracz klatki piersiowej.
  3. Należy przygotować gazę bawełnianą i aplikatory w celu opanowania krwawienia.
  4. Należy ustawić temperaturę homeotermicznego systemu koca (maty grzewczej), służącego do utrzymania temperatury ciała zwierzęcia na poziomie 37±1°C, aby zapobiec gwałtownemu spadkowi temperatury ciała; wielkość zawału zależy od czasu trwania okluzji, jak i od temperatury ciała (Tarnavski et al.).
  5. Przed znieczuleniem, dzień przed operacją, każde zwierzę otrzyma dawkę buprenorfiny (0,1-2,5 mg/kg SQ) oraz tabletkę karprofenu do podania doustnego (Rimadyl, tabletka Bioserv; 1 tabletka). Bezpośrednio przed operacją każde zwierzę ponownie otrzyma dawkę buprenorfiny (0,1-2,5 mg/kg SQ).
  6. Uwaga: W badaniach obejmujących ocenę funkcji serca i przebudowy serca w dłuższym okresie (od 7 do 28 dni i dłużej), dawkę buprenorfiny (0,1-2,5 mg/kg SQ) należy podawać co 6 godzin po operacji przez 24-48 godzin po zabiegu, a tabletki karprofenu do podania doustnego należy podawać raz dziennie (patrz „Rekonwalescencja pooperacyjna”).

2. Przygotowanie i intubacja szczurów

  1. Przed wprowadzeniem w stan znieczulenia zwierzęta zostaną poddane badaniu w celu zidentyfikowania wszelkich istniejących schorzeń, które mogłyby skomplikować wynik operacji; badanie fizykalne obejmie inspekcję wizualną oraz pomiar częstości akcji serca, częstości oddechów, temperatury ciała i masy ciała.
  2. Jeśli zwierzęta zostaną uznane za zdrowe, samce szczurów (np. Sprague Dawley) o masie 250-300 g zostaną zważone, a ich cechy identyfikacyjne zostaną zapisane.
  3. Szczury zostają następnie znieczulone dawką 80 mg/kg pentobarbitalu; prawidłowy poziom znieczulenia weryfikuje się poprzez reakcję wycofania kończyny poprzez wywieranie nacisku na łożysko paznokcia szczura (odruch uciskania palca) oraz okresowo w trakcie całego zabiegu.
  4. W momencie operacji zostanie podana buprenorfina (0,1-2,5 mg/kg; SQ).
  5. Następnie za pomocą golarki elektrycznej ogala się futro z obszaru szyi i klatki piersiowej. Uwaga: W badaniach obejmujących ocenę funkcji serca i przebudowy serca w określonym czasie (od 7 do 28 dni i dłużej), futro musi zostać całkowicie usunięte z obszaru operacyjnego w celu zachowania sterylności.
  6. Wygolone obszary należy wyszorować i zdezynfekować roztworem betadyny, a następnie przetrzeć obszar 70% alkoholem; tę procedurę szorowania i dezynfekcji betadyną i alkoholem należy powtórzyć trzykrotnie.
  7. Znieczulone zwierzę umieszcza się następnie w pozycji na plecach na systemie koca homeotermicznego (podkładka grzewcza) w celu utrzymania temperatury ciała.
  8. Następnie wykonuje się intubację endotrachealną, zaczynając od ostrożnego odsłonięcia tchawicy w celu poprawy widoczności podczas intubacji, poprzez wykonanie 5 mm nacięcia w połowie szyi i odsunięcie tkanki mięśniowej tuż nad tchawicą.
  9. Umożliwia to lepszą widoczność przy wprowadzaniu rurki endotrachealnej (polietylen roz. 90; PE 90), której koniec jest ścięty pod kątem w celu ułatwienia przejścia przez krtań.
  10. Rurkę endotrachealną wprowadza się do tchawicy, wspomagając widoczność za pomocą chirurgicznego stereomikroskopu, ostrożnie manipulując językiem podczas obserwacji tchawicy i wejścia rurki endotrachealnej.
  11. Wentylację mechaniczną uzyskuje się poprzez podłączenie rurki endotrachealnej do respiratora Kent Scientific (TOPO Dual Mode) z częstotliwością 80 oddechów na minutę i objętością oddechową 1,2 ml na 100 g masy ciała.
  12. Następnie na szczurze kładzie się sterylną draperię, pozostawiając odsłonięty tylko obszar operacyjny, co minimalizuje potencjalne zanieczyszczenie podczas operacji.
  13. Chirurg zwierzęcy i asystenci muszą nosić maski, fartuchy i rękawiczki; rękawiczki należy zmieniać pomiędzy operacjami poszczególnych szczurów.

3. Przejściowe podwiązanie lewej przedniej tętnicy zstępującej (LAD)

  1. Po ustabilizowaniu oddechu klatkę piersiową otwiera się na wysokości czwartej przestrzeni międzyżebrowej po lewej stronie, wykorzystując kleszczyki hemostatyczne lub nożyczki z zaokrąglonymi końcami do rozszerzenia przestrzeni, bez przecinania tkanek, aby zminimalizować ryzyko krwawienia.
  2. Następnie w czwartej przestrzeni międzyżebrowej umieszcza się rozwierak do klatki piersiowej w celu rozsunięcia żeber i odsłonięcia lewej komory (LV), zachowując maksymalną ostrożność, aby nie uszkodzić płuca.
  3. Następnie otwiera się osierdzie, pozostawiając je w miejscu, jeśli to możliwe.
  4. Przy użyciu chirurgicznego mikroskopu stereoskopowego identyfikuje się proksymalny odcinek lewej tętnicy wieńcowej przedniej zstępującej (LAD) (Rycina-1), a następnie LAD zostaje przejściowo podwiązana (lub związana za pomocą węzła ślizgowego) nicią z prolenu 6-0 na 30-minutowy okres niedokrwienia (Rycina-1), bez eksternalizacji serca.
  5. Aby umożliwić reperfuzję serca, 30 minut po podwiązaniu LAD używa się nożyczek mikrochirurgicznych do przecięcia węzła podwiąзки (lub poprzez zwolnienie węzła ślizgowego) wykonanego nicią z prolenu 6-0.
  6. U szczurów w grupie kontrolnej (sham) procedura jest identyczna, z wyjątkiem tego, że LAD nie jest przejściowo podwiązywana.
  7. Następnie krótko (1-2 sekundy) zaciska się wylot respiratora, aby umożliwić ponowne napuszczenie płuc.
  8. Następnie usuwa się rozwierak i zbliża żebra za pomocą nici z prolenu 2-0, stosując szew przerywany.
  9. Po zamknięciu żeber wylot respiratora zostaje ponownie krótko (1-2 sekundy) zakleszczony, aby zapewnić prawidłowe oddychanie.
  10. Skórę zamyka się nicią z prolenu 6-0, stosując szew ciągły.

4. Potwierdzenie prawidłowej ligacji tętnicy LAD

  1. Prawidłowe podwiązanie LAD zostanie potwierdzone poprzez obserwację bladości tkanki mięśnia sercowego dystalnie od szwu oraz dysfunkcji ściany przedniej, podobnie jak obserwowano podczas przejściowego podwiązania LAD.
  2. Reperfusję zweryfikuje się poprzez powrót czerwonego koloru tkanki mięśnia sercowego oraz wykazanie częściowego powrotu ruchomości ściany przedniej, co obserwowano bezpośrednio po przejściowym podwiązaniu LAD.
  3. Uwaga: W badaniach obejmujących ocenę funkcji i przebudowy serca w czasie (od 7 do 28 dni i dłużej), 24 godziny po podwiązaniu LAD zostanie wykonane echo serca w celu określenia zakresu indukowanego zawału mięśnia sercowego. Wszystkie zwierzęta z frakcją skrócenia lewej komory (LV FS) < 20%, określoną na podstawie echokardiogramu, a także z dysfunkcją ruchomości ściany przedniej zgodną z zawałem, zostaną wyselekcjonowane do dalszych badań nad funkcją i przebudową serca. Oczekuje się, że szczury w grupie kontrolnej (sham) będą miały prawidłową LV FS w zakresie 40-45% (del Monte et al).

5. Rekonwalescencja pooperacyjna

  1. Po zakończeniu operacji należy usunąć sterylną draperię z ciała zwierzęcia. Do momentu, aż zwierzę odzyska zdolność poruszania się, należy monitorować temperaturę ciała (za pomocą termometru rektalnego), częstość oddechów (poprzez inspekcję wizualną), tętno (poprzez palpację) oraz niepokojące objawy bólowe.
  2. Szczura należy odłączyć od respiratora, a następnie umieścić w klatce, aby mógł dojść do siebie po znieczuleniu. Jeden koniec klatki powinien być ogrzewany za pomocą mata grzewczego, aby szczur mógł szukać ciepła. Podczas tego okresu obserwacji szczur musi mieć dostęp do wody.
  3. W przypadku zaobserwowania objawów odwodnienia po operacji, należy wstrzyknąć 0,5 ml sterylnej soli fizjologicznej dojlaśniewkowo (IP).
  4. Buprenorfinę (0,1‐2,5 mg/kg; SQ) należy podać bezpośrednio po operacji oraz w czasie rekonwalescencji pooperacyjnej.
  5. Uwaga: W badaniach obejmujących ocenę funkcji serca i przebudowy mięśnia sercowego w dłuższym okresie (od 7 do 28 dni i więcej), dawkę buprenorfiny (0,1-2,5 mg/kg SQ) należy podawać co 6 godzin przez 24-48 godzin po operacji. Należy również podawać doustne tabletki karprofenu (Rimadyl, tabletka Bioserv) w dawce 1 tabletki dziennie przez co najmniej 48 godzin po operacji.

6. Ocena histologiczna reperfuzji po niedokrwieniu

  1. Po zakończeniu 4-godzinnego okresu reperfuzji szczury ponownie znieczula się dawką 80 mg/kg pentobarbitalu, a następnie ponownie podwiązuje się LAD (lub zaciska ponownie węzeł poślizgowy) (Huang et al i Kaiser et al).
  2. Następnie 1 ml 5% błękitu Evansa (w soli fizjologicznej buforowanej fosforanowo) wstrzykuje się do prawej komory serca i pozostawia do perfuzji na 2 minuty.
  3. Po 2 minutach do prawej komory serca wstrzykuje się 1 ml nasyconego roztworu chlorku potasu w celu zatrzymania akcji serca.
  4. Serce jest następnie szybko wycinane, osadzane w 2% agarozie w soli fizjologicznej buforowanej fosforanowo, a następnie cięte na plastry o grubości 1-2 mm.
  5. Żywe mięsień sercowy barwi się 2% chlorkiem trifenylotetrazolium (TTC) przez 20 minut, a następnie wykonuje się zdjęcia każdego plastra. Obrazy są następnie analizowane ilościowo w celu określenia powierzchni mięśnia sercowego: (1) niezagrożonej (sekcje niebieskie), (2) obszaru zagrożonego (AAR; sekcje czerwone i białe) oraz (3) obszaru zawałowego (białe sekcje „niezbarwione”) (Rycina-2).

7. Reprezentatywne wyniki

W badaniach obejmujących ocenę wielkości zawału i obszaru zagrożonego (AAR) za pomocą barwnika błękitu Evansa i chlorku trifenylotetrazolium (TTC) po 4 godzinach reperfuzji, prawidłowe podwiązanie LAD można potwierdzić, obserwując bladość tkanki mięśnia sercowego dystalnie względem szwu, a także dysfunkcję ściany przedniej, co jest zauważalne podczas przejściowego podwiązania LAD. Reperfuzję można zweryfikować poprzez powrót czerwonego koloru tkanki mięśnia sercowego oraz wykazanie częściowego powrotu ruchomości ściany przedniej, co obserwuje się bezpośrednio po przejściowym podwiązaniu LAD. W badaniach obejmujących ocenę funkcji serca i przebudowy serca w określonym czasie (od 7 do 28 dni i dłużej), prawidłowe podwiązanie w celu wywołania niedokrwienia, a następnie reperfuzję można również potwierdzić poprzez bladość tkanki, dysfunkcję ściany przedniej oraz powrót czerwonego koloru wraz z częściowym powrotem ruchomości ściany po reperfuzji. Ponadto, upośledzenie funkcji serca można określić za pomocą echokardiografii wykonanej 24 godziny po podwiązaniu LAD, aby ustalić zakres wywołanego zawału mięśnia sercowego. Wszystkie zwierzęta z frakcją skrócenia lewej komory (LV FS) < 20%, określoną na podstawie echokardiografii, a także z dysfunkcją ruchomości ściany przedniej zgodną z zawałem, zostaną wytypowane i wykorzystane do dalszych badań nad funkcją i przebudową serca. Oczekuje się, że szczury z grupy kontrolnej (sham) będą miały prawidłową LV FS w zakresie 40-45% (del Monte).

figure-protocol-1
Rysunek 1. Schemat zawału mięśnia sercowego i ligacji LAD. Schemat (1) zawału mięśnia sercowego oraz (2) ligacji lewej tętnicy wieńcowej opadającej przedniej (LAD) za pomocą szwu, stosowanej w celu imitacji zawału mięśnia sercowego spowodowanego powstaniem blaszki miażdżycowej.

figure-protocol-2
Rycina 2. Reprezentatywny obraz serca szczura po AMI. Reprezentatywny obraz serca szczura pokazujący obszar na niebiesko (obszar niezakleszczonej perfuzji wieńcowej), obszar na czerwono (obszar zakleszczonej perfuzji wieńcowej wskazujący obszar zagrożony (AAR) zawałem) oraz obszar na biało/żółto (strefa zawału w obrębie AAR).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Ostry zawał mięśnia sercowego (AMI) u szczurów, nazywany również niedokrwieniem-reperfuzją (IR), jest powszechnie stosowany do naśladowania ludzkiego remodelingu komór prowadzącego do niewydolności serca. Postęp dysfunkcji LV i niewydolności serca w modelach zwierzęcych (szczurach i myszach) jest podobny do tego obserwowanego u ludzi, którzy doznali zawału mięśnia sercowego, przeżyli, a następnie rozwinęła się u nich niewydolność serca (Goldman). Niniejsza procedura przedstawia jedną wersję tej techniki i zawiera dodatko...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

B.K.M. otrzymuje wsparcie z grantu National Institute of Health (NIH) / National Heart Lung and Blood Institute (NHLBI) (R01- HL085487). M.H. otrzymuje wsparcie z grantu American Heart Association National (AHA) Scientist Development Grant (SDG) oraz od Society of Geriatric Cardiology.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
RespiratorKent ScientificTOPOTOPO Dual Mode
Cyrkulator termostatyczny E103Harvard Apparatus732802
System koców homeotermicznychHarvard Apparatus55-7222F
StereomikroskopNikon InstrumentsMMA36300Stereomikroskop z zoomem SMZ-645
Sterylizator perłowyHarvard Apparatus610183
Golarka elektrycznaGE Healthcare
Ostrza i uchwytyWelch Allyn690047-1Standardowe ostrza laryngoskopu (lampowe)
Nożyczki chirurgiczneFine Science Tools14014-17
Nożyczki chirurgiczneFine Science Tools14072-10
PincetaFine Science Tools11028-15
Pinceta zakrzywionaFine Science Tools11001-12
Zaginalacz igiełFine Science Tools12004-18
Zaginalacz igiełFine Science Tools91201-13
Rozwierak klatki piersiowejFine Science Tools17008-07
MaskiVWR international47730-640
Gazy chirurgiczneDermacea441205
Rękawiczki sterylneCardinal Health2D7203I
Przewody PE 90BD Biosciences427420
Strzykawka 20 mlBD Biosciences301625
Nici Prolene 6-0Ethicon Inc.8706H
Nici jedwabne 2-0Ethicon Inc.K873H
Pentobarbital sodu w zastrzykuOVATION PharmaceuticalsNDC 67386-501-55
Powidone-jodNOVAPLUSV10-8204
BuprenorfinaPharmaceuticals Inc.NDC 12496-0757-1

Bibliografia

  1. Hunt, S. A., Baker, D. W., Chin, M. H., Cinquegrani, M. P., Feldmanmd, A. M., Francis, G. S., Ganiats, T. G., Goldstein, S., Gregoratos, G., Jessup, M. L., Noble, R. J., Packer, M., Silver, M. A., Stevenson, L. W. SC.ACC/AHA Guidelines for the Evaluation and Management of Chronic Heart Failure in the Adult: Executive Summary A Report of the American College of Cardiology/American Heart Association Task Force on Practice Guidelines (Committee to Revise the 1995 Guidelines for the Evaluation and Management of Heart Failure). Circulation. 104, 2996-3007 (2001).
  2. Goldman, S., Raya, T. E. Rat infarct model of myocardial infarction and heart failure. J Card Fail. 1, 169-177 (1995).
  3. Tarnavski, O., McMullen, J. R., Schinke, M., Nie, Q., Kong, S., &, I. zumo, S, Mouse cardiac surgery: comprehensive techniques for the generation of mouse models of human diseases and their application for genomic studies. Physiol Genomics. 16, 349-360 (2004).
  4. Thygesen, K., Alpert, J. S. Universal Definition of Myocardial Infarction. Circulation. 116, 2634-2653 (2007).
  5. Vasilyev, N., Williams, T., Brennan, M. L., Unzek, S., Zhou, X., Heinecke, J. W., Spitz, D. R., Topol, E. J., Hazen, S. L., Penn, M. S. Myeloperoxidase-generated oxidants modulate left ventricular remodeling but not infarct size after myocardial infarction. Circulation. 112, 2812-2820 (2005).
  6. McConnell, B. K., Popovic, Z., Mal, N., Lee, K., Bautista, J., Forudi, F., Schwartzman, R., Jin, J. P., Penn, M., Bond, M. Disruption of protein kinase A interaction with A-kinase-anchoring proteins in the heart in vivo: effects on cardiac contractility, protein kinase A phosphorylation, and troponin I proteolysis. J Biol Chem. 284, 1583-1592 (2009).
  7. Monte, D. el, Butler, F., Boecker, K., Gwathmey, W., K, J., Hajjar, R. J. Novel technique of aortic banding followed by gene transfer during hypertrophy and heart failure. Physiol. Genomics. 9, 49-56 (2002).
  8. Huang, M. H., Nguyen, V., Wu, Y., Rastogi, S., McConnell, B. K., Wijaya, C., Uretsky, B. F., Poh, K. K., Tan, H. C., Cheng, J., Perin, E., Fujise, K. Synergistic Infarct Size Reduction by Combination Therapy with Milrinone and Esmolol at Early Reperfusion during Acute Myocardial Infarction. American Journal of Physiology. , Forthcoming Forthcoming.
  9. Kaiser, R. A., Bueno, O. F., Lips, D. J., Doevendans, P. A., Jones, F., Kimball, T. F., Molkentin, J. D. Targeted inhibition of p38 mitogen-activated protein kinase antagonizes cardiac injury and cell death following ischemia-reperfusion in vivo. J Biol Chem. 279, 15524-15530 (2004).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Model szczuralewa przednia t tnica wie cowaniedokrwienie i reperfusjaocena wielko ci zawa uobszar zagro onybarwnik b kit Evansachlorek trifenylotetrazolireperfusja sercaligacja chirurgiczna

Powiązane artykuły