Szczurzy model ostrego zawału mięśnia sercowego (AMI) jest przydatny do badania skutków zawału dla patofizjologicznych i fizjologicznych funkcji serca.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Ostry zawał mięśnia sercowego u szczurów
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
W obliczu faktu, że niewydolność serca jest główną przyczyną zgonów w USA (Hunt), badania biomedyczne mają fundamentalne znaczenie dla rozwoju metod leczenia chorób układu sercowo-naczyniowego. Modele zwierzęce naśladujące ludzkie choroby serca, takie jak zawał mięśnia sercowego (MI) i niedokrwienie-reperfuzja (IR) wywołujące niewydolność serca, a także przeciążenie ciśnieniowe (poprzeczne zwężenie aorty) indukujące przerost serca i niewydolność serca (Goldman and Tarnavski), stanowią przydatne modele do badania chorób sercowo-naczyniowych. W szczególności niedokrwienie mięśnia sercowego (MI) jest główną przyczyną zachorowalności i śmiertelności sercowo-naczyniowej, pomimo kontrolowania niektórych czynników ryzyka, takich jak tętnicowstępność, oraz stosowania interwencji chirurgicznych (Thygesen). Co więcej, ostra utrata mięśnia sercowego w następstwie niedokrwienia mięśnia sercowego (MI) prowadzi do zwiększenia obciążenia, co indukuje remodeling komory brzusznej w strefie przyzawałowej oraz w odległych obszarach nieobjętych zawałem. Apoptoza i nekroza miocytów oraz wynikający z nich zwiększony ładunek hemodynamiczny aktywują liczne wewnątrzkomórkowe szlaki sygnalizacyjne, które inicjują rozszerzenie LV, przerost, deformację kształtu komory oraz tworzenie blizny kolagenowej. Ten patologiczny remodeling i brak normalizacji zwiększonych naprężeń ściany prowadzą do postępującego rozszerzenia, włączania mięśnia sercowego ze strefy przyzawałowej do blizny, a ostatecznie do pogorszenia kurczliwości mięśnia sercowego (tj. niewydolności serca). Postęp dysfunkcji LV i niewydolności serca u szczurów jest podobny do tego, który obserwuje się u pacjentów przeżywających rozległy zawał mięśnia sercowego, u których następnie rozwija się niewydolność serca (Goldman). Model ostrego zawału mięśnia sercowego (AMI) u szczurów jest wykorzystywany do naśladowania ludzkich chorób sercowo-naczyniowych; konkretnie do badania mechanizmów sygnalizacji kardiologicznej związanych z niewydolnością serca, a także do oceny skuteczności strategii terapeutycznych w leczeniu niewydolności serca. Metoda opisana w niniejszym raporcie to szczurzy model ostrego zawału mięśnia sercowego (AMI). Model ten nazywany jest również ostrą kardiomiopatią niedokrwienną lub niedokrwieniem z następującą reperfuzją (IR); jest on indukowany 30-minutowym okresem ostrego niedokrwienia poprzez podwiązanie lewej przedniej tętnicy zstępującej (LAD), a następnie reperfuzją tkanki po zwolnieniu podwiązania LAD (Vasilyev and McConnell). Niniejszy protokół koncentruje się na ocenie wielkości zawału oraz obszaru zagrożonego (AAR) przy użyciu barwnika błękitu Evansa i chlorku trifenylotetrazolium (TTC) po 4 godzinach reperfuzji; przedstawiono również dodatkowe uwagi dotyczące oceny funkcji serca i remodelingu poprzez modyfikację czasu trwania reperfuzji. Ogólnie rzecz biorąc, ten zwierzęcy model AMI u szczurów jest przydatny do badania następstw zawału mięśnia sercowego w zakresie patofizjologicznych i fizjologicznych funkcji serca.
Protokół
1. Przygotowanie obszaru operacyjnego
- Powierzchnię roboczą należy najpierw przygotować, dezynfekując obszar 70% etanolem.
- Wszystkie instrumenty chirurgiczne muszą zostać wysterylizowane w sterylizatorze perłowym przed operacją (oraz pomiędzy kolejnymi operacjami na szczurach). Instrumenty te obejmują: nożyczki chirurgiczne (2), pęsetę (1), pęsetę zakrzywioną (1), uchwyt do igieł (2) oraz retraktor klatki piersiowej.
- W celu opanowania krwawienia należy przygotować gazę bawełnianą i aplikatory.
- Ustaw temperaturę systemu koca homeotermicznego (podkładki grzewczej), który posłuży do utrzymania temperatury ciała zwierzęcia na poziomie 37±1°C, aby zapobiec gwałtownemu spadkowi temperatury ciała; wielkość obszaru zawału zależy zarówno od czasu trwania okluzji, jak i od temperatury ciała (Tarnavski et al.).
- Przed znieczuleniem, dzień przed operacją, każde zwierzę otrzyma dawkę buprenorfiny (0,1-2,5 mg/kg SQ) oraz tabletki doustne karprofenu (Rimadyl, Bioserv tablet; 1 tabletka). Bezpośrednio przed operacją każde zwierzę otrzyma ponownie dawkę buprenorfiny (0,1-2,5 mg/kg SQ).
- Uwaga: W badaniach obejmujących ocenę funkcji serca i przebudowy serca w określonym czasie (od 7 do 28 dni i dłużej), dawkę buprenorfiny (0,1-2,5 mg/kg SQ) należy podawać co 6 godzin po operacji przez okres 24-48 godzin po zabiegu, a tabletki doustne karprofenu podawać raz dziennie (patrz „Rekuperacja pooperacyjna”).
2. Przygotowanie i intubacja szczurów
- Przed wprowadzeniem znieczulenia zwierzęta zostaną poddane badaniu w celu zidentyfikowania wszelkich istniejących schorzeń, które mogą skomplikować wynik operacji; badanie fizykalne obejmie inspekcję wizualną oraz pomiar tętna, częstotliwości oddychania, temperatury ciała i masy ciała.
- Jeśli zwierzęta zostaną uznane za zdrowe, samce szczurów o masie 250-30 gramów (np. Sprague Dawley) zostaną zważone, a ich cechy identyfikacyjne zostaną odnotowane.
- Następnie szczury są znieczulane dawką 80 mg/kg pentobarbitalu; prawidłowy poziom znieczulenia jest weryfikowany poprzez reakcję wycofania kończyny poprzez ucisk łożyska paznokcia szczura (odruch uszczypnięcia palca) i powtarzany okresowo w trakcie procedury.
- Buprenorfina (0,1-2,5 mg/kg; SQ) zostanie podana w czasie operacji.
- Następnie używa się golarki elektrycznej do usunięcia futra z obszarów szyi i klatki piersiowej. Uwaga: W badaniach obejmujących ocenę funkcji serca i przebudowy serca w określonym czasie (od 7 do 28 dni i dłużej), futro musi zostać całkowicie usunięte z obszaru chirurgicznego w celu zachowania sterylności.
- Wygolone obszary należy wyszorować i zdezynfekować roztworem betadyny, a następnie przetrzeć obszar 70% alkoholem; tę procedurę szorowania i dezynfekcji betadyną i alkoholem należy powtórzyć trzykrotnie.
- Znieczulone zwierzę zostaje następnie umieszczone w pozycji na plecach na homeotermicznym systemie koca (mata grzewcza) w celu utrzymania temperatury ciała.
- Następnie przeprowadza się intubację endotrachealną, najpierw ostrożnie odsłaniając tchawicę, aby usprawnić wizualizację intubacji, poprzez wykonanie 5 mm nacięcia w środkowej części szyi i odsunięcie tkanki mięśniowej bezpośrednio nad tchawicą.
- Umożliwia to lepszą wizualizację podczas wprowadzania rurki endotrachealnej (polietylenowej rozmiar 90; PE 90), której końcówka jest ścięta dla ułatwienia przejścia przez krtani.
- Rurkę endotrachealną wprowadza się do tchawicy, wspomagając wizualizację za pomocą chirurgicznego mikroskopu stereoskopowego, ostrożnie manipulując językiem podczas obserwacji tchawicy i wejścia rurki endotrachealnej.
- Wentylację mechaniczną uzyskuje się poprzez podłączenie rurki endotrachealnej do respiratora Kent Scientific (TOPO Dual Mode) z częstotliwością 80 oddechów na minutę i objętością oddechową 1,2 ml na 10 gramów masy ciała.
- Następnie na szczurze umieszcza się sterylną chustę, pozostawiając odsłonięty jedynie obszar chirurgiczny, co minimalizuje potencjalne zanieczyszczenie podczas operacji.
- Chirurg zwierzęcy oraz asystenci powinni nosić maski, fartuchy i rękawiczki; rękawiczki należy zmieniać pomiędzy operacjami poszczególnych szczurów.
3. Przejściowe podwiązanie lewej przedniej tętnicy zstępującej (LAD)
- Po ustabilizowaniu oddychania klatka piersiowa zostaje otwarta na wysokości czwartej przestrzeni międzyżebrowej po lewej stronie, wykorzystując kleszczyki hemostatyczne lub nożyczki z zaokrąglonymi końcami do rozdzielenia przestrzeni, bez przecinania tkanek, aby zminimalizować ryzyko krwawienia.
- Następnie w czwartej przestrzeni międzyżebrowej umieszcza się rozieracz klatki piersiowej w celu rozsunięcia żeber, aby odsłonić lewą komorę (LV), zachowując maksymalną ostrożność, by nie uszkodzić płuca.
- Następnie otwierany jest osierdzie, jednak w miarę możliwości pozostawia się je na miejscu.
- Przy użyciu chirurgicznego mikroskopu stereoskopowego identyfikuje się proksymalny odcinek lewej tętnicy wieńcowej przedniej zstępującej (LAD) (Rysunek-1), a następnie LAD zostaje przejściowo podwiązana (lub można zastosować węzeł poślizgowy) nicią Prolene 6-0 na 30-minutowy okres niedokrwienia (Rysunek-1), bez eksponowania serca na zewnątrz.
- Aby umożliwić reperfuzję serca, po 30 minutach od podwiązania LAD, używa się nożyczek mikrosurgicalnych do przecięcia węzła ligatury (lub poprzez zwolnienie węzła poślizgowego) wykonanej nicią Prolene 6-0.
- W szczurach grupy kontrolnej (sham) procedura jest identyczna, z wyjątkiem tego, że LAD nie jest przejściowo podwiązywana.
- Następnie na krótko (1-2 sekundy) zaciska się wylot respiratora, aby umożliwić ponowne napompowanie płuc.
- Następnie usuwa się rozieracz klatki piersiowej i zbliża żebra, stosując szew przerywany nicią Prolene 2-0.
- Po zamknięciu żeber wylot respiratora ponownie zaciska się na krótko (1-2 sekundy), aby zapewnić prawidłowy oddech.
- Skórę zamyka się szwem ciągłym nicią Prolene 6-0.
4. Potwierdzenie prawidłowego podwiązania tętnicy LAD
- Prawidłowe podwiązanie LAD zostanie potwierdzone poprzez obserwację bladości tkanki mięśnia sercowego dystalnie od szwu oraz dysfunkcji przedniej ściany, analogicznie do obserwacji podczas przejściowego podwiązania LAD.
- Reperfuzja zostanie zweryfikowana poprzez powrót czerwonego koloru tkanki mięśnia sercowego oraz wykazanie częściowego powrotu ruchomości przedniej ściany, analogicznie do obserwacji bezpośrednio po przejściowym podwiązaniu LAD.
- Uwaga: W badaniach obejmujących ocenę funkcji serca i przebudowy serca w określonym czasie (od 7 do 28 dni i dłużej), w 24 godziny po podwiązaniu LAD zostanie wykonane badanie echokardiograficzne w celu określenia zakresu wywołanego zawału mięśnia sercowego. Wszystkie zwierzęta z frakcją skrócenia lewej komory (LV FS) < 20%, określoną na podstawie echokardiogramu, oraz z dysfunkcją ruchomości przedniej ściany zgodną z zawałem, zostaną zidentyfikowane i wykorzystane do dalszych badań nad funkcją i przebudową serca. Przewiduje się, że szczury w grupie kontrolnej (sham) będą miały prawidłową wartość LV FS w przedziale 40-45% (del Monte et al).
5. Rekonwalescencja pooperacyjna
- Po zakończeniu operacji należy zdjąć jałowe pole chirurgiczne z organizmu zwierzęcia. Temperaturę ciała (za pomocą termometru rektalnego), częstotliwość oddechów (poprzez obserwację wizualną), czynność serca (poprzez palpację) oraz niepokojące objawy bólowe należy monitorować aż do momentu, gdy zwierzę odzyska zdolność poruszania się.
- Szczura należy odłączyć od respiratora, umieścić w klatce i pozwolić mu wybudzić się z anestezji. Jeden koniec klatki powinien być ogrzewany za pomocą mata grzewczego, aby szczur mógł samodzielnie szukać ciepła. W okresie obserwacyjnym zwierzę musi mieć dostęp do wody.
- W przypadku wystąpienia objawów odwodnienia po operacji, należy wstrzyknąć 0,5 ml jałowej soli fizjologicznej do jamy otrzewnej (IP).
- Buprenorfinę (0,1‐2,5 mg/kg; SQ) należy podać bezpośrednio po operacji oraz w trakcie rekonwalescencji pooperacyjnej.
- Uwaga: W badaniach obejmujących ocenę funkcji serca i przebudowy mięśnia sercowego w dłuższym okresie (od 7 do 28 dni i więcej), dawkę buprenorfiny (0,1-2,5 mg/kg SQ) należy podawać co 6 godzin przez 24-48 godzin po zabiegu. Należy również podawać tabletki doustne karprofenu (Rimadyl, Bioserv tablet) (1 tabletka dziennie) przez co najmniej 48 godzin po operacji.
6. Ocena histologiczna niedokrwienia i reperfuzji
- Po zakończeniu 4-godzinnego okresu reperfuzji szczury należy ponownie znieczulić dawką 80 mg/kg pentobarbitalu i ponownie podwiązać LAD (lub ponownie zawiązać węzeł poślizgowy) (Huang et al i Kaiser et al).
- Następnie do prawej komory serca wstrzykuje się 1 ml 5% błękitu Evansa (w soli fizjologicznej buforowanej fosforanowo) i pozwala na perfuzję przez 2 minuty.
- Po 2 minutach do prawej komory serca wstrzykuje się 1 ml nasyconego roztworu chlorku potasu w celu zatrzymania akcji serca.
- Następnie szybko wycina się serce, zatapia w 2% agarozie w soli fizjologicznej buforowanej fosforanowo, a następnie tnie na plastry o grubości 1-2 mm.
- Żywą tkankę mięśnia sercowego barwi się 2% chlorkiem trifenylotetrazoliu (TTC) przez 20 minut i wykonuje zdjęcia każdego plastra. Następnie dokonuje się ilościowej analizy obrazów w celu określenia obszaru mięśnia sercowego, który: (1) nie jest zagrożony (sekcje niebieskie), (2) jest obszarem zagrożonym (AAR; sekcje czerwone i białe) oraz (3) jest obszarem zawałowym (białe sekcje „niezbarwione”) (Rycina 2).
7. Reprezentatywne wyniki
W badaniach obejmujących ocenę wielkości zawału oraz obszaru zagrożonego (AAR) za pomocą barwnika błękitu Evansa i chlorku trifenylotetrazolią (TTC) po 4 godzinach reperfuzji, prawidłowość podwiązania LAD można potwierdzić, obserwując bladość tkanki mięśnia sercowego dystalnie w stosunku do szwu, a także dysfunkcję ściany przedniej, co jest widoczne podczas przejściowego podwiązania LAD. Reperfuzję można zweryfikować poprzez powrót czerwonego koloru do tkanki mięśnia sercowego i wykazanie częściowego powrotu ruchomość ściany przedniej, co obserwuje się bezpośrednio po przejściowym podwiązaniu LAD. W badaniach obejmujących ocenę funkcji serca i przebudowy serca w określonym czasie (od 7 do 28 dni i dłużej), prawidłowość wywołania niedokrwienia a następnie reperfuzji można również potwierdzić poprzez bladość tkanki, dysfunkcję ściany przedniej oraz powrót czerwonego koloru wraz z częściową regeneracją ruchomości ściany po reperfuzji. Dodatkowo upośledzenie funkcji serca można określić za pomocą echokardiografii wykonanej 24 godziny po podwiązaniu LAD, aby ustalić zakres wywołanego zawału mięśnia sercowego. Wszystkie zwierzęta z frakcją skrócenia lewej komory (LV FS) < 20%, określoną na podstawie echokardiografii, a także z dysfunkcją ruchomości ściany przedniej zgodną zawałem, zostaną wyselekcjonowane i wykorzystane do dalszych badań nad funkcją i przebudową serca. Przewiduje się, że szczury w grupie kontrolnej (sham) będą miały prawidłowy LV FS w zakresie 40-45% (del Monte).
Rycina 1. Schematyczna ilustracja zawału mięśnia sercowego i podwiązania tętnicy LAD. Schematyczna ilustracja (1) zawału mięśnia sercowego oraz (2) podwiązania tętnicy przedniej zstępującej lewej komory (LAD) za pomocą szwu, stosowanej w celu symulacji zawału mięśnia sercowego wywołanego tworzeniem się blaszki miażdżycowej.
Rycina 2. Reprezentatywny obraz serca szczura po AMI. Reprezentatywny obraz serca szczura przedstawiający obszar na niebiesko (nieokluzyjny obszar perfuzji wieńcowej), obszar na czerwono (okluzyjny obszar perfuzji wieńcowej wskazujący obszar zagrożony (AAR) zawałem) oraz obszar na biało/żółto (strefa zawału w obrębie AAR).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Ostry zawał mięśnia sercowego (AMI) u szczurów, nazywany również niedokrwieniem-reperfuzją (IR), jest powszechnie stosowany do naśladowania ludzkiego remodelingu komór prowadzącego do niewydolności serca. Postęp dysfunkcji LV i niewydolności serca w modelach zwierzęcych (szczurach i myszach) jest podobny do tego obserwowanego u ludzi, którzy doznali zawału mięśnia sercowego, przeżyli, a następnie rozwinęła się u nich niewydolność serca (Goldman). Niniejsza procedura przedstawia jedną wersję tej techniki i zawiera dodatko...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
B.K.M. otrzymuje wsparcie z grantu National Institute of Health (NIH) / National Heart Lung and Blood Institute (NHLBI) (R01- HL085487). M.H. otrzymuje wsparcie z grantu American Heart Association National (AHA) Scientist Development Grant (SDG) oraz od Society of Geriatric Cardiology.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Respirator | Kent Scientific | TOPO | TOPO Dual Mode |
| Cyrkulator termostatyczny E103 | Harvard Apparatus | 732802 | |
| System koców homeotermicznych | Harvard Apparatus | 55-7222F | |
| Stereomikroskop | Nikon Instruments | MMA36300 | Stereomikroskop z zoomem SMZ-645 |
| Sterylizator perłowy | Harvard Apparatus | 610183 | |
| Golarka elektryczna | GE Healthcare | ||
| Ostrza i uchwyty | Welch Allyn | 690047-1 | Standardowe ostrza laryngoskopu (lampowe) |
| Nożyczki chirurgiczne | Fine Science Tools | 14014-17 | |
| Nożyczki chirurgiczne | Fine Science Tools | 14072-10 | |
| Pinceta | Fine Science Tools | 11028-15 | |
| Pinceta zakrzywiona | Fine Science Tools | 11001-12 | |
| Zaginalacz igieł | Fine Science Tools | 12004-18 | |
| Zaginalacz igieł | Fine Science Tools | 91201-13 | |
| Rozwierak klatki piersiowej | Fine Science Tools | 17008-07 | |
| Maski | VWR international | 47730-640 | |
| Gazy chirurgiczne | Dermacea | 441205 | |
| Rękawiczki sterylne | Cardinal Health | 2D7203I | |
| Przewody PE 90 | BD Biosciences | 427420 | |
| Strzykawka 20 ml | BD Biosciences | 301625 | |
| Nici Prolene 6-0 | Ethicon Inc. | 8706H | |
| Nici jedwabne 2-0 | Ethicon Inc. | K873H | |
| Pentobarbital sodu w zastrzyku | OVATION Pharmaceuticals | NDC 67386-501-55 | |
| Powidone-jod | NOVAPLUS | V10-8204 | |
| Buprenorfina | Pharmaceuticals Inc. | NDC 12496-0757-1 |
Bibliografia
- Hunt, S. A., Baker, D. W., Chin, M. H., Cinquegrani, M. P., Feldmanmd, A. M., Francis, G. S., Ganiats, T. G., Goldstein, S., Gregoratos, G., Jessup, M. L., Noble, R. J., Packer, M., Silver, M. A., Stevenson, L. W. SC.ACC/AHA Guidelines for the Evaluation and Management of Chronic Heart Failure in the Adult: Executive Summary A Report of the American College of Cardiology/American Heart Association Task Force on Practice Guidelines (Committee to Revise the 1995 Guidelines for the Evaluation and Management of Heart Failure). Circulation. 104, 2996-3007 (2001).
- Goldman, S., Raya, T. E. Rat infarct model of myocardial infarction and heart failure. J Card Fail. 1, 169-177 (1995).
- Tarnavski, O., McMullen, J. R., Schinke, M., Nie, Q., Kong, S., &, I. zumo, S, Mouse cardiac surgery: comprehensive techniques for the generation of mouse models of human diseases and their application for genomic studies. Physiol Genomics. 16, 349-360 (2004).
- Thygesen, K., Alpert, J. S. Universal Definition of Myocardial Infarction. Circulation. 116, 2634-2653 (2007).
- Vasilyev, N., Williams, T., Brennan, M. L., Unzek, S., Zhou, X., Heinecke, J. W., Spitz, D. R., Topol, E. J., Hazen, S. L., Penn, M. S. Myeloperoxidase-generated oxidants modulate left ventricular remodeling but not infarct size after myocardial infarction. Circulation. 112, 2812-2820 (2005).
- McConnell, B. K., Popovic, Z., Mal, N., Lee, K., Bautista, J., Forudi, F., Schwartzman, R., Jin, J. P., Penn, M., Bond, M. Disruption of protein kinase A interaction with A-kinase-anchoring proteins in the heart in vivo: effects on cardiac contractility, protein kinase A phosphorylation, and troponin I proteolysis. J Biol Chem. 284, 1583-1592 (2009).
- Monte, D. el, Butler, F., Boecker, K., Gwathmey, W., K, J., Hajjar, R. J. Novel technique of aortic banding followed by gene transfer during hypertrophy and heart failure. Physiol. Genomics. 9, 49-56 (2002).
- Huang, M. H., Nguyen, V., Wu, Y., Rastogi, S., McConnell, B. K., Wijaya, C., Uretsky, B. F., Poh, K. K., Tan, H. C., Cheng, J., Perin, E., Fujise, K. Synergistic Infarct Size Reduction by Combination Therapy with Milrinone and Esmolol at Early Reperfusion during Acute Myocardial Infarction. American Journal of Physiology. , Forthcoming Forthcoming.
- Kaiser, R. A., Bueno, O. F., Lips, D. J., Doevendans, P. A., Jones, F., Kimball, T. F., Molkentin, J. D. Targeted inhibition of p38 mitogen-activated protein kinase antagonizes cardiac injury and cell death following ischemia-reperfusion in vivo. J Biol Chem. 279, 15524-15530 (2004).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
