Wizualizacja i ocena rozmiaru Faustovirusa przy użyciu mikroskopii elektronowej

Streszczenie

Źródło: Bou Khalil, J. Y., et al. A Rapid Strategy for the Isolation of New Faustoviruses from Environmental Samples Using Vermamoeba vermiformis. J. Vis. Exp. (2016).

W niniejszym filmie zaprezentowano obrazowanie cząsteczek faustowirusa z zainfekowanej hodowli ameb przy użyciu transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Materiał obejmuje przygotowanie siateczki, barwienie negatywne molibdanem amonu w celu zwiększenia kontrastu oraz wizualizację wirusa pod mikroskopem. Protokół kończy się pomiarem wielkości faustowirusa przy użyciu zintegrowanych narzędzi programowych mikroskopu.

Protokół

1. Mikroskopia elektronowa
   1. Po wstępnej identyfikacji na preparatach, oceń obecność wirusa olbrzymiego poprzez obserwację kultur nadsączu za pomocą mikroskopii elektronowej.
   2. Nanieś 5 µl pozytywnej próbki na siateczkę poddaną wyładowaniom koronowym (glow-discharge). Odczekaj około 20 minut w temperaturze pokojowej.
   3. Ostrożnie osusz siateczkę, a następnie nanieś na nią małą kroplę 1% molibdenianu amonu na 10 sec. Pozostaw siateczkę do wyschnięcia na 5 min.
   4. Przeprowadź badanie mikroskopem elektronowym przy napięciu 200 keV.
   5. Umieść siateczkę w uchwycie, a następnie wprowadź uchwyt do mikroskopu. Sprawdź podgląd próżni, klikając odpowiednią ikonę. Zamknij zawory i rozpocznij obserwację przy rozmiarze plamki (spot size) 5 i powiększeniu x 25,000.
   6. Zmierz wirusa olbrzymiego za pomocą programu ImageJ lub bezpośrednio w mikroskopie, korzystając z narzędzia pomiarowego znajdującego się na ekranie akwizycji.
      UWAGA: Próbkę zaklasyfikuj do grupy Faustovirus, jeżeli rozmiar kapsydu wynosi około 200 nm.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Szczep ameby CDC-19	ATCC	France	50237
Płytki	Cellstar	France	655180
Filtry próżniowe	Thermo scientific	France	BPV4550 / 20170115
Bufor solny z fosforanami (PBS)	Thermo Fisher scientific	France	10010-023
Barwnik DAPI	Life Technologies	France	D1306
Siatki węglowe	Euromedex	France	FCF400NI
Molibdan amonu	VWR internationanl	France	21276185
Kolby	SARSTEDT	Germany	833911
Filtry 0.22 μm	Milex millipor	France	SE2M229104
Ultracentryfuga Sorval WX 80	Thermo scientific	France	9102448
Filtry szybkiego przepływu	Nalgene	France	450-0020