Izolacja i oczyszczanie wirusów z ciał zainfekowanych owadów

Streszczenie

Źródło: Biesbrock, A. M. et al. Propagation of Homalodisca coagulata virus-01 via Homalodisca vitripennis Cell Culture. J. Vis. Exp. (2014)

W tym filmie zaprezentowano propagację in vitro wirusa Homalodisca coagulata Virus-01 z wykorzystaniem komórek gospodarza pochodzących od owadów. Przedstawiono w nim etapy oczyszczania wirusa, inokulacji oraz replikacji w hodowlach komórkowych owadów.

Protokół

1. Ekstrakcja całych wirusów

1. Homogenizować całe ciała osobników H. vitripennis dodatnich pod kątem wirusa w buforze fosforanowym o pH ~7,2 z 0,02% trihydratem dietylditiokarbaminianu sodu (DETCA), mieszając w wirówce typu vortex w odstępach ~10 s, aż do całkowitego rozpadu dużych grudek tkanki. Wyekstrahować wirusa poprzez ultrawirowanie przy 124 500 x g przez 4 hr w 4 °C lub 22 000 x g przez 16 hr w 4 °C. Jeśli na powierzchni utworzy się osad, usunąć go za pomocą sterylnego patyczka bawełnianego.
2. Odlać nadosad.
3. Zebrać osad i rozpuścić go w 5 ml 10 mM buforu fosforanowego (bez DETCA) o pH ~7,2, zawierającego 0,4% kwasu Na-deoksycholowego i 4% eteru heksydecylu glikolu polietylenowego (Brij 52).
   1. W celu dokładnego wymieszania osadu, w razie potrzeby oddzielić go od ścianki probówki i rozetrzeć, aż do całkowitego rozpuszczenia.
   2. W razie potrzeby dodawać dodatkowy 10 mM bufor fosforanowy w porcjach ~5 ml, aby wspomóc rozpuszczanie osadu, a następnie rozdzielić zawartość do 2 probówek.
4. Wirować roztwór przy 300 x g przez 15 min.
5. Usunąć nadosad, przefiltrować roztwór przez filtr 0,45 μm i zebrać filtrat do dużej probówki zbiorczej.
6. Przenieść filtrat na membranę dializacyjną o granicy odcięcia masy cząsteczkowej (MWCO) 3,5 kD, w razie potrzeby używając niewielkich ilości 10 mM buforu fosforanowego (pH 7) bez DETCA.
7. Umieścić membranę dializacyjną w dużym zlewce wypełnionym ddH₂O w 4 °C. Wymieniać ddH₂O co godzinę przez 5–6 hr, aż w membranie pojawi się biały osad.
8. Zebrać oczyszczonego wirusa z wnętrza membrany, a 100% roztwór wirusa poddać 10-krotnemu szeregowi rozcieńczeń, dodając 10 μl roztworu do 90 μl ddH₂O. Następnie dodawać 10 μl rozcieńczenia do kolejnych 90 μl ddH₂O, aż do uzyskania rozcieńczenia 1:100 000.
9. Przechowywać roztwór wirusa w -80 °C.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Corning cell culture flasks	Sigma Aldrich	CLS430168	Powierzchnia 25 cm², skośny szyjka, zatyczka (uszczelnienie korkowe)
Olympus DP30BW, IX2-SP, IX71	Olympus		Mikroskop odwrócony i kamera
Greiner CELLSTAR multiwell culture plates	Sigma Aldrich	M8937	48 dołków (traktowane TC, z pokrywką)
DETCA	Sigma Aldrich	228680	Trihydrat dietylditiokarbaminianu sodu
Corning bottle-top vacuum filter system	Sigma Aldrich	CLS431206	Membrana z octanu celulozy, wielkość porów 0.45 μm, powierzchnia membrany 54.5 cm², pojemność filtra 500 ml
Brij 52	Sigma Aldrich	388831	Polyethylene glycol hexadecyl ether
Phosphate buffer solution	Sigma Aldrich	P5244	Otrzymano jako 100 mM, rozcieńczono do 10 mM wodą sterylną
PBS	Sigma Aldrich	P5368	Fosforanowo-buforowana sól fizjologiczna
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma Aldrich	A2153
Grace’s Insect medium (supplemented, 1x)	Sigma Aldrich	G8142	Składnik pożywki H2G+ dla skoczków
L-histidine monohydrate	Sigma Aldrich	H8125	Składnik pożywki H2G+ dla skoczków
Medium 199 (10x)	Sigma Aldrich	M4530	Składnik pożywki H2G+ dla skoczków
Medium 1066 (1x)	Sigma Aldrich	C0422	Składnik pożywki H2G+ dla skoczków
Hank’s Balanced Salts (1x)	Sigma Aldrich	51322C	Składnik pożywki H2G+ dla skoczków
L-Glutamine (100x)	Sigma Aldrich	G3126	Składnik pożywki H2G+ dla skoczków
MEM, amino acid mix (50x)	Sigma Aldrich	56419C	Składnik pożywki H2G+ dla skoczków
1 M MgCl solution	Sigma Aldrich	M8266	Składnik pożywki H2G+ dla skoczków
Pen-Strep	Sigma Aldrich	G6784	Składnik pożywki H2G+ dla skoczków
Nystatin	Sigma Aldrich	N6261	Składnik pożywki H2G+ dla skoczków
Gentamycin	Sigma Aldrich	46305	Składnik pożywki H2G+ dla skoczków
Dextrose	Sigma Aldrich	D9434	Składnik pożywki H2G+ dla skoczków
Fetal Bovine Serum	Sigma Aldrich	F2442	Składnik pożywki H2G+ dla skoczków