Ocena hamowania rozprzestrzeniania się wirusa poprzez wyciszanie genomu za pomocą mimetyków microRNA

Streszczenie

Źródło: Ruiz, A. J. and Russell, S. J. MicroRNA-based Regulation of Picornavirus Tropism. J. Vis. Exp. (2017)

W niniejszym filmie zaprezentowano wykorzystanie syntetycznych mimików microRNA do selektywnego hamowania replikacji wirusowej w hodowlach komórek nabłonkopodobnych. Przedstawiono w nim, w jaki sposób wyciszanie genomu kierowane przez microRNA może blokować rozprzestrzenianie się wirusa oraz potwierdzać specyficzność celowania poprzez analizę zakaźności w kolejnych etapach.

Protokół

1. Ocena specyficzności celowania microRNA: test rozprzestrzeniania wirusa z użyciem syntetycznych mimików microRNA

UWAGA: Stosuje się syntetyczny mimik microRNA w celu wykazania specyficzności oddziaływania microRNA:cel-microRNA.

1. Aby ocenić toksyczność indukowaną przez microRNA, w każdym teście należy uwzględnić kontrole: mock transfection (transfekcję pozorowaną), mimik microRNA jako kontrolę negatywną oraz sam mimik microRNA jako kontrolę eksperymentalną. Wskazane jest również zastosowanie kontroli pozytywnej (np. genu lub genomu będącego celem microRNA), ponieważ niska wydajność transfekcji mimików microRNA może prowadzić do wyników fałszywie ujemnych.
2. Komórki H1-HeLa wysiać na 96-dołkową płytkę do hodowli tkankowej tak, aby w momencie transfekcji (24 h po wysianiu) osiągnęły 80-90% konfluencji. Komórki wysiać w DMEM (Dulbecco’s modified eagle medium) uzupełnionym o 10% płodowej surowicy bydlęcej w ilości 0,1 mL na dołek.
   UWAGA: Test ten należy przeprowadzać na komórkach podatnych na replikację wirusa, które nie wykazują ekspresji cognate microRNAs.
3. Odgrzać odczynniki do transfekcji do temperatury pokojowej. Połączyć 9 µL medium bezsurowiczego, roztwór zapasowy mimika microRNA (docelne stężenie 200 nM na dołek), 0,18 µL odczynnika boost oraz 0,18 µL odczynnika do transfekcji, a następnie wymieszać. Mieszaninę inkubować w temperaturze pokojowej przez 2-5 min.
   UWAGA: Podane objętości dotyczą jednego dołka. Aby zachować spójność i zminimalizować błędy pipetowania, zaleca się przygotowanie master mixu do transfekcji wszystkich dołków. Optymalne stężenie mimika microRNA może być różne. W celu ustalenia odpowiedniego stężenia początkowego należy zapoznać się z instrukcją producenta dołączoną do mimika microRNA. Zazwyczaj mieści się ono w zakresie od 5-200 nM stężenia końcowego.
4. Odssać medium z dołków i dodać 92 µL świeżego medium kompletnego.
   UWAGA: W przypadku dużej liczby próbek należy wykonać ten krok przed przygotowaniem roztworu do transfekcji i przechowywać płytkę w temperaturze 37 °C do czasu rozpoczęcia procedury.
5. Całą mieszaninę do transfekcji dodać do komórek kroplami.
6. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 6 h.
7. Zainfekować każdy dołek przy niskim MOI (Multiplicity of infection), aby zapewnić zainfekowanie niskiego odsetka komórek, co umożliwi analizę rozprzestrzeniania się wirusa. W tym protokole zastosowano MOI = 0,2.
   1. Rozcieńczyć zapasy wirusa w medium bezsurowiczym do stężenia MOI = 0,2 na 100 µL. Usunąć medium z dołków i dodać 100 µL rozcieńczonego wirusa na dołek.
   2. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 2 h.
8. Odssać medium z każdego dołka i dodać 100 µL świeżego medium kompletnego.
9. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 20-22 h.
10. Wyznaczyć miano wirusa w nadsączach.
    1. Zebrać nadsącz z każdego dołka i zastąpić go 100 µL świeżego medium kompletnego.
       UWAGA: W przypadku stosowania komórek w zawiesinie, osad komórkowy z następnego kroku resuspendować w 100 µL świeżego medium kompletnego i przenieść z powrotem do dołka z próbką w celu przeprowadzenia testu żywotności.
    2. Usunąć z zebranych nadsączów szczątki komórkowe poprzez wirowanie przy 300 x g przez 5 min w temperaturze 4 °C.
    3. Przenieść oczyszczony nadsącz do nowej probówki i oznaczyć miano wirusa zakaźnego na komórkach podatnych, które nie wykazują ekspresji cognate microRNAs. 
       UWAGA: Wszystkie próbki należy przechowywać w lodzie, aby zapobiec utracie zakaźności.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Woda wolna od nukleaz	Fisher Scientific	AM9938
TransIT-2020 Transfection reagent	Mirus	MIR 5404
TransIT-mRNA Transfection reagent	Mirus	MIR 2225
Probówki 2 mL z nakrętką	Sarstedt	72.694.005
Mimety microRNA	Dharmacon	Różne
Test proliferacji komórek MTT	ATCC	30-1010K