Produkcja i pozyskiwanie terapeutycznych komórek nabłonkowych produkujących wirusy

Streszczenie

Źródło: Heidbuechel, J. P., et al. Paramyxoviruses for Tumor-targeted Immunomodulation: Design and Evaluation Ex Vivo. J. Vis. Exp. (2019).

W niniejszym filmie zaprezentowano proces zakażania komórek nabłonka nerek wirusami zmodyfikowanymi genetycznie w celu ich produkcji oraz etap zbioru w celu zbadania replikacji wirusowej.

Protokół

1. Wyznaczanie zdolności replikacyjnych i cytotoksycznych wektorów wirusowych kodujących immunomodulatory

Porównaj kinetykę replikacji wytworzonego wirusa rekombinowanego i niezmodyfikowanego wektora za pomocą jednokrokowych lub wielokrokowych krzywych wzrostu (GC). W przypadku jednokrokowych GC potomstwo wirusowe jest oceniane po jednoczesnym zakażeniu wszystkich komórek (teoretycznie 100% zakażeń). Wielokrokowe GC rozpoczynają się od niskiego odsetka zakażonych komórek, aby umożliwić obserwację kilku rund replikacji wirusa.

1. W celu analizy kinetyki replikacji wirusa odry, jeden dzień przed infekcją wysiać 1 x 10⁵ komórek Vero w 1 mL DMEM (podłoża Eagle'a modyfikowanego przez Dulbecco) z 10% FBS (płodowej surowicy bydlęcej) na dołek w płytkach 12-dołkowych. Dla każdego punktu czasowego wysiać co najmniej dwa dołki jako powtórzenia techniczne.
2. Zainfekować komórki wirusem przy niskim MOI (wielokrotności infekcji) dla wieloetapowych lub przy wysokim MOI dla jednoetapowych krzywych wzrostu (odpowiednio 0,03 i 3 dla MV, czyli wirusa odry) podczas replikacji na komórkach Vero. Zastąpić podłoże 300 µL podłoża bezsurowiczego zawierającego odpowiednią ilość wirusa i inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ przez co najmniej 2 h. Usunąć inokulum, dodać 1 mL DMEM z 10% FBS i kontynuować inkubację.
3. W odpowiednich punktach czasowych, takich jak 12, 24, 36, 48, 72 i 96 h po infekcji, zebrać potomstwo wirusowe poprzez bezpośrednie zeskrobanie komórek do podłoża. Przenieść zawartość każdego dołka do osobnej probówki, zamrozić gwałtownie w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu miareczkowania.
   UWAGA: Próbki z powtórzeń można na tym etapie połączyć w celu analizy średnich mianrów.
4. Zebrać próbki ze wszystkich punktów czasowych. Rozmrozić jednocześnie w temperaturze 37 °C w celu oceny potomstwa wirusowego. Wymieszać w wirówce i odwirować szczątki komórkowe przez 5 min przy 2 500 x g i 4 °C.
5. Obliczyć średnie mianry dla każdego konstruktu i punktu czasowego zgodnie z powyższym opisem. Przedstawić mianry w funkcji czasu. Porównać krzywe wzrostu wektorów z wstawionymi transgenami i bez nich, z różnymi transgenami lub z transgenami wstawionymi w różnych pozycjach (patrz Rycina 1).

Wyniki

Rysunek 1: Kinetyka replikacji i aktywność lityczna rekombinowanych wirusów odry. (A) Jednoetapowe krzywe wzrostu wygenerowano po zakażeniu komórek Vero niemodyfikowanym onkolitycznym wirusem odry (MV) lub wirusem odry kodującym bispecyficzny aktywator limfocytów T (MV-H-mCD3xhCD20) przy MOI wynoszącym 1. Miana potomstwa wirusowego oceniano w wyznaczonych punktach czasowych po zakażeniu, co wykazało podobną kinetykę replikacji wirusów. Przedstawiono średnie i odchylenia standardowe z ośmiu próbek (po cztery powtórzenia techniczne dla dwóch powtórzeń biologicznych w każdym punkcie czasowym). (B) Żywotność komórek oceniano na komórkach raka jelita grubego myszy MC38 stabilnie ekspresujących ludzki antygen rakowo-embrionalny oraz receptor MV CD46 (MC38-CEA-CD46) po inokulacji samym medium (mock) lub wskazanymi wirusami przy MOI wynoszącym 1. Test żywotności komórek XTT przeprowadzono w zaznaczonych punktach czasowych. Spadek żywotności komórek zaobserwowano w wcześniejszych punktach czasowych dla wektora niemodyfikowanego. Wartości powyżej 100%, obliczone dla MV-H-mCD3xhCD20 w 12 h, są często obserwowane krótko po zakażeniu, co może wynikać ze stresu komórkowego lub czynników pochodzenia komórkowego obecnych w zawiesinie wirusa. Dla każdego punktu czasowego przedstawiono wartości średnie wraz z odchyleniami standardowymi z trzech powtórzeń technicznych.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)	Invitrogen, Darmstadt, Germany	31966-021	Stosowany do wysiewania i infekcji komórek Vero
Fetal Bovine Serum (FBS)	Biosera, Boussens, France	FB-1280/500	Do suplementacji DMEM
Komórki Vero	ATCC, Manassas, VA, USA	CCL81	Komórki gospodarza do propagacji i analizy wirusa odry
Płytki 12-dołkowe	Neolab, Heidelberg, Germany	353043	Do wysiewania komórek Vero (1 × 10⁵ na dołek)
Opti-MEM (poziomka bezsurowicza)	Gibco Life Technologies, Darmstadt, Germany	31985070	Do etapu infekcji wirusem (inkubacja bezsurowicza)
Phosphate-Buffered Saline (PBS)	Gibco Life Technologies, Darmstadt, Germany	14190-094	Do płukania i przygotowania pożywek
Cell lifter	Corning, Reynosa, Mexico	3008	Stosowany do zeskrobywania zainfekowanych komórek podczas zbioru
Probówki 50 mL	nerbe plus, Winsen/Luhe, Germany	02-572-3001	Do zbierania próbek i wirowania
Ciekły azot	—	—	Do błyskawicznego mrożenia zebranych próbek wirusowych
Wirówka (zdolna do 2,500 × g)	—	—	Do osadzania resztek komórkowych
XTT Cell Viability Kit (Colorimetric Cell Viability Kit III)	PromoKine, Heidelberg, Germany	PK-CA20-300-1000	Zawiera odczynnik XTT; do pomiaru cytotoksyczności
Płytki 96-dołkowe, płaskodenne	Neolab, Heidelberg, Germany	353072	Do pomiaru absorbancji przy 450 nm
Spektrofotometr / Czytnik mikropłytek	—	—	Do pomiaru absorbancji optycznej przy 450 nm (referencja 630 nm)
Inkubator z dwutlenkiem węgla	—	—	37 °C, 5% CO₂ dla wszystkich inkubacji komórkowych