Ocena aktywności immunomodulacyjnej wirusowo kodowanego bispecyficznego aktywatora limfocytów T

Streszczenie

Źródło: Heidbuechel, J. P., et al. Paramyxoviruses for Tumor-targeted Immunomodulation: Design and Evaluation Ex Vivo. J. Vis. Exp. (2019).

W niniejszym filmie zaprezentowano test komórkowy służący do oceny celowanej aktywności immunomodulującej wirusowo kodowanego bispecyficznego aktywatora limfocytów T (BTE). BTE łączy komórki nowotworowe wykazujące ekspresję receptora docelowego z limfocytami T, co wywołuje lizę nowotworu i uwalnianie enzymów. Odczyt kolorymetryczny, oparty na konwersji substratu, wskazuje na aktywację limfocytów T. Wyższa intensywność barwy w próbce badanej potwierdza receptorowo swoiste zaangażowanie układu odpornościowego zapośredniczone przez BTE.

Protokół

1. Ocena funkcjonalności immunologicznej wyizolowanych immunomodulatorów.
   1. Poniżej szczegółowo opisano sposób oceny cytotoksyczności komórkowej indukowanej przez bispecyficzne przeciwciała aktywujące limfocyty T (BTE) za pomocą testu uwalniania dehydrogenazymleczanowej (LDH).
      1. Należy określić warunki do przetestowania podczas eksperymentu (przykład przedstawiono na Rysunku 1). Można modyfikować punkty czasowe (od godzin do dni), stężenia immunomodulatora (od pg/mL do µg/mL) oraz stosunki komórek efektorowych do docelowych (E:T) (na przykład od 1:50 do 50:1). Próbki należy zawsze przygotowywać w trzech powtórzeniach.
      2. Należy uwzględnić próbki bez białka BTE i bez komórek efektorowych, kontrole spontanicznego uwalniania LDH dla pojedynczych typów komórek (Tsp i Esp), kontrolę maksymalnej lizy komórek docelowych (Tmax) z dodatkiem detergentu przed odczytem, kontrolę zawierającą samo medium oraz kontrolę objętości dla Tmax.
         UWAGA: Wymagana liczba komórek docelowych i czasy inkubacji mogą się różnić. Należy przeprowadzić wstępne testy bez komórek efektorowych i immunomodulatorów w celu zidentyfikowania optymalnych parametrów. Należy uwzględnić próbki Tsp i Tmax oraz odpowiadające im kontrole, aby ocenić różne liczby komórek i punkty czasowe.
      3. Wyizolować komórki efektorowe układu odpornościowego (np. poprzez wirowanie gradientowe krwi ludzkiej w celu uzyskania mononuklearnych komórek krwi obwodowej (PBMC) lub negatywną selekcję limfocytów T mysich ze splenocytów mysich).
      4. Zasiać komórki docelowe (np. 5 x 10³ na dołek) na płytce 96-dołkowej z dnem w kształcie litery U.
      5. Dodać wyizolowane białko w pożądanych stężeniach do odpowiednich próbek. Dodać komórki efektorowe w pożądanych stosunkach. Dodać medium do całkowitej objętości 100 µL na dołek.
      6. Inkubować przez wyznaczony czas, zazwyczaj od 4 do 48 h (24 h dla niepobudzonych PBMC i 48 h dla świeżo wyizolowanych limfocytów T mysich; krótsze czasy inkubacji mogą mieć zastosowanie do wstępnie pobudzonych komórek odpornościowych), w temperaturze 37 °C i 5% CO₂.
      7. Na 45 minut przed pobraniem próbek dodać 10 µL 10-krotnego roztworu lizującego do dołków zawierających próbki Tmax i odpowiadające im kontrole z medium. Kontynuować inkubację.
      8. Odwirować komórki z prędkością 250 x g przez 4 min. Przenieść 50 µL każdego supernatantu na płytkę 96-dołkową z płaskim dnem. Nie przenosić komórek, aby uniknąć obecności LDH związanej z komórkami.
      9. Przygotować roztwór substratu zgodnie z instrukcją producenta. Dodać 50 µL do każdego dołka i inkubować w temperaturze pokojowej [RT] w ciemności przez 30 min lub do momentu, aż próbki Tmax nabiorą ciemnoczerwonego koloru.
      10. Dodać 50 µL roztworu stopującego do każdego dołka. Usunąć pęcherzyki powietrza poprzez wirowanie przez 1 min przy 4 000 x g oraz ręcznie za pomocą pustej igły. Zmierzyć absorbancję optyczną przy 490 nm.
      11. Obliczyć wartości % lizy specyficznej dla każdej próbki.
          1. Obliczyć średnie dla powtórzeń kontroli z medium z roztworem lizującym i bez niego. Odjąć otrzymane wartości odpowiednio od próbek eksperymentalnych oraz od kontroli Tmax i spontanicznego uwalniania. Uzyskane wartości skorygowane o tło wykorzystać do dalszych obliczeń.
          2. Obliczyć średnie dla skorygowanych o tło kontroli Tmax, Tsp i Esp. Przy użyciu tych średnich wartości następujące równanie pozwala wyznaczyć procent lizy specyficznej dla każdej próbki:
             
          3. Przedstawić wartości % lizy specyficznej w funkcji stężenia białka lub stosunku E:T i porównać je z próbkami kontrolnymi niecelującymi.

Wyniki

Rysunek 1: Aktywność cytotoksyczna BTE kodowanych przez wirusa odry. Komórki nowotworowe docelowe (5 x 10³ komórek B16-CD20-CD46 na dołek) inkubowano z mysimi limfocytami T w stosunku 1:50. Dodano BTE (bispecyficzne aktywatory limfocytów T) uprzednio oczyszczone z nadsączu komórek zainfekowanych MV(wirusem odry)-H-mCD3xhCD20 w indicated stężeniach. Względną lizę komórek docelowych oceniono za pomocą testu uwalniania LDH po 48 h. Jako referencję do oceny cytotoksyczności specyficznej dla antygenu posłużyły komórki pozbawione antygenu docelowego BTE (B16-CD46). Przedstawiono średnie wraz z odchyleniem standardowym dla trzech powtórzeń technicznych na próbkę. Komórki wykazujące ekspresję antygenu docelowego uległy specyficznej lizie w sposób zależny od stężenia BTE. Czystość produktu BTE oraz poziomy ekspresji antygenu docelowego wpływają na zabijanie komórek. W niniejszym przykładzie osiągnięto 15% specyficznego zabijania komórek przy stosunkowo wysokim stężeniu BTE wynoszącym 1 µg/mL. Jest to typowa wartość dla takiego układu eksperymentalnego z długim czasem współinkubacji i suboptimalnymi warunkami hodowli limfocytów T. W innych konfiguracjach, przy użyciu BTE oczyszczonych z nadsączów zainfekowanych MV, osiągnięto do 60% specyficznego zabijania, przy czym plateau osiągano przy stężeniach BTE 100 ng/mL i wyższych. Wskazuje to, że wbrew intuicji, górna granica tego testu jest niższa niż 100% specyficznego zabijania, co można wyjaśnić różną kinetyką wzrostu w kontrolach Tmax w porównaniu do próbek z współhodowlą.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
podłoże DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium)	Invitrogen, Darmstadt, Niemcy	31966-021
Płodowa surowica bydlęca (FBS)	Biosera, Boussens, Francja	FB-1280/500
Kanamycyna	Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Niemcy	K0129
B16-CD46/ B16-CD20-CD46	J. Heidbuechel, DKFZ Heidelberg		dostępne na żądanie
Kolorymetryczny Zestaw do Oceny Żywotności Komórek III (XTT)	PromoKine, Heidelberg, Niemcy	PK-CA20-300-1000	zawiera odczynnik XTT
Sól fizjologiczna Dulbecco (PBS)	Gibco Life Technologies, Darmstadt, Niemcy	14190-094
Kolumny wirówkowe QIAquick Ni-NTA	QIAGEN, Hilden, Niemcy	31014
płytki 96-dołkowe, z dnem w kształcie litery U	TPP, Trasadingen, Szwajcaria	92097
płytki 96-dołkowe, płaskodenne	Neolab, Heidelberg, Niemcy	353072