Produkcja cząstek retrowirusowych do transferu genów

Streszczenie

Źródło: Zjablovskaja, P., et al., Proliferation and Differentiation of Murine Myeloid Precursor 32D/G-CSF-R Cells. J. Vis. Exp. (2018)

Niniejszy film prezentuje metodę produkcji rekombinowanych cząstek retrowirusowych poprzez transfekcję ludzkich komórek opakowujących pochodzących z nerki, co umożliwia stabilną dostawę genów do komórek docelowych w zastosowaniach takich jak modyfikacje genetyczne, testy funkcjonalne lub badania nad różnicowaniem linii komórkowych.

Protokół

1. Produkcja retrowirusa
   1. Wysiać zawiesinę pojedynczych komórek Bosc23 (6 × 10⁶) na szalkę Petriego o średnicy 16 cm i hodować w 18 mL DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) zawierającego 10% FBS (płodowa surowica bydlęca), aż konfluencja kultury osiągnie 80% (24 h).
      UWAGA: Komórki powinny rosnąć w monowarstwie i nie tworzyć aglomeratów w hodowli. Liczenie komórek można przeprowadzić różnymi metodami (obowiązuje to również dla pozostałych protokołów przedstawionych w niniejszym opracowaniu). W przypadku niewielkiej liczby próbek zaleca się ręczne liczenie pod mikroskopem przy użyciu komory Bürkera. W takim przypadku należy zastosować błękit trypanu do wykluczenia martwych komórek. Komórki należy zmieszać w stosunku 1:1 z 0,4% błękitu trypanu w PBS (bufor fosforanowy). Do liczenia dużej liczby próbek można użyć automatycznego licznika komórek.
   2. Połączyć 40 µg konstruktu retrowirusowego (np. MSCV), 20 µg pCL-Eco (wektor pakujący), 80 µl PEI (polyethylenimine) oraz 2 mL pożywki z obniżoną zawartością surowicy (np. Opti-MEM (Minimum Essential Medium)) bez antybiotyków. Mieszaninę inkubować przez 20 min w temperaturze pokojowej (RT).
   3. Ostrożnie zastąpić pożywkę komórek Bosc23 16 mL DMEM uzupełnionego o 2% FBS. Przed użyciem podgrzać pożywkę do 37 °C.
      UWAGA: Podczas transfekcji nie należy stosować antybiotyków, ponieważ mogą one obniżyć wydajność transfekcji.
   4. Mieszaninę przygotowaną w punkcie 1.2. dodawać kroplowo i ostrożnie do kultury Bosc23, a następnie inkubować przez 4 h w 37 °C. Ze względu na toksyczność PEI czas inkubacji nie powinien przekraczać 6 h.
   5. Po inkubacji zmienić pożywkę Bosc23 na 18 mL podgrzanego DMEM zawierającego 10% FBS i hodować komórki przez 48 h w 37 °C. Szalki należy umieścić w laboratorium o 2. poziomie bezpieczeństwa biologicznego (BSL-2) i przestrzegać standardowych procedur bezpieczeństwa.
   6. Zebrać pożywkę Bosc23 (zawierającą ekotropowe cząstki retrowirusa) za pomocą pipety serologicznej 25 mL do probówki stożkowej 50 mL i przechowywać w 4 °C.
      UWAGA: (Ważne) Wydajność transfekcji powinna osiągnąć 90%, aby uzyskać wirusa o wysokim mianie.
   7. Dodać do komórek Bosc23 18 mL podgrzanego DMEM z 10% FBS i hodować przez 24 h.
   8. Powtórzyć krok 1.6.
      UWAGA: Nadnadmiary retrowirusowe z kroków 1.6 i 1.8 można połączyć po osiągnięciu przez nie tej samej temperatury (4 °C), aby zachować integralność wirusa.
   9. Aby uniknąć zanieczyszczenia nadnadmiarów wirusowych komórkami Bosc23, zebrany wirus wirować przy 1500 × g przez 10 min w 4 °C. Wirus podzielić na alykwooty, zamrozić gwałtownie w suchym lodzie lub ciekłym azocie i przechowywać w -80 °C. Należy jednak pamiętać, że świeżo przygotowany wirus charakteryzuje się wyższą jakością pod kątem wydajności infekcji niż zapasy mrożone.
      UWAGA: (Ważne) Należy unikać wielokrotnego zamrażania i rozmrażania wirusa, ponieważ prowadzi to do jego degradacji.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	15028
Opti-MEM ((Minimum Essential Medium) - pożywka o obniżonej zawartości surowicy	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	31985-047	L-glutamina, czerwień fenolowa
Płodowa surowica bydlęca (FBS)	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	10270	Stosowana do hodowli komórek HEK293T, NIH3T3, BOSC23
Penicylina	Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)	P3032
Streptomycyna	Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)	S9137	Sól siarczanowa streptomycyny w proszku
Gentamycyna	Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)	G1914
Polyethylenimine	Polyscience, Warrington, PA, USA	23966	Liniowy, MW 25,000 (PEI 25000)