Odzyskiwanie zakaźnych wirionów z komórek transfekowanych syntetycznym RNA pochodzącym z bakteryjnego sztucznego chromosomu

Streszczenie

Źródło: Yun, S. et al. Bacterial Artificial Chromosomes: A Functional Genomics Tool for the Study of Positive-strand RNA Viruses. J. Vis. Exp. (2015)

Niniejszy film przedstawia odzyskiwanie zakaźnego wirusa zapalenia mózgu japońskiego z syntetycznego RNA przetranskrybowanego z klonu bakteryjnego chromosomu sztucznego. Pokazuje on proces elektroporacji komórek syntetycznym RNA, co pozwala genomowi wirusa na kierowanie produkcją nowych wirionów. Powstałe w wyniku tego plaki w zakażonych monowarstwach komórek potwierdzają pomyślne odzyskanie zakaźnego wirusa.

Protokół

1. Określanie zakaźności RNA i miana wirusa

1. Hodować komórki BHK-21 (baby hamster kidney-21) w naczyniach hodowlanych o średnicy 150 mm przy gęstości 3 × 10⁶ komórek/naczynie przez 24 h w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO₂.
   UWAGA: Komórki BHK-21 utrzymywać w pożywce alpha-MEM (alpha minimum essential medium) uzupełnionej o 10% płodowej surowicy bydlęcej, 2 mM glutaminy, witaminy oraz penicylinę/streptomycynę.
2. Przepłukać monowarstwę komórek 10 ml zimnego roztworu A (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8,1 mM Na₂HPO₄ i 1,5 mM KH₂PO₄). Odczepić komórki z naczyń poprzez traktowanie 4 ml trypsyny z kwasem etylendiaminotetraoctowym (EDTA) (0,25%) i zebrać je poprzez wirowanie przy 270 × g w wirówce stołowej przez 2 min.
3. Resuspendować osad komórkowy w 50 ml zimnego roztworu A w probówce stożkowej o pojemności 50 ml i wirować zawiesinę komórkową przy 270 × g przez 2 min. Powtórzyć tę procedurę płukania trzykrotnie; po ostatnim płukaniu resuspendować osad komórkowy do gęstości 2 × 10⁷ komórek/ml w roztworze A.
4. Wymieszać 400 µl alikwotu zawiesiny komórkowej z 2 µg syntetycznego RNA w kuwecie z przerwą 2 mm i niezwłocznie przeprowadzić elektroporację mieszaniny za pomocą elektroporatora przy optymalnych parametrach: 980 V, czas trwania impulsu 99 µsec i 5 impulsów (Rysunek 1C).
5. Pozostawić elektroporowane komórki w temperaturze pokojowej (RT) przez 10 min, a następnie przenieść je do mikroprobówki o pojemności 1,7 ml zawierającej 600 µl pełnej pożywki hodowlanej.
6. Przygotować 10-krotne rozcieńczenia seryjne elektroporowanych komórek w 1 ml pełnej pożywki hodowlanej i nanieść 100 µl alikwotu każdego rozcieńczenia na monowarstwy nieelektroporowanych komórek BHK-21 (5 × 10⁵) w płytce 6-dołkowej.
7. Po 4–6 h inkubacji przykryć komórki 0,5% agarozą w pożywce minimal essential medium zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej. Inkubować płytki przez 4 dni w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO₂.
8. Zwizualizować centra infekcyjne (placki) poprzez fiksację 7% formaldehydem i barwienie 1% fioletem krystalicznym w 5% etanolu (Rysunek 2A).
   1. Opcjonalnie: Przebadać komórki poddane elektroporacji RNA w 18–20 h po transfekcji pod kątem ekspresji białek wirusa japońskiego zapalenia mózgu (JEV) za pomocą testów immunofluorescencyjnych (Rysunek 2B), a następnie zebrać supernatanty z komórek poddanych elektroporacji RNA w 22. i 40. godzinie po transfekcji w celu miareczkowania wirusa za pomocą metody plackowej (Rysunek 2C).

Wyniki

Rycina 1. Przegląd procesu odzyskiwania zakaźnych wirusów z pełnowymiarowego komplementarnego DNA (cDNA) JEV SA₁₄-14-2 zmontowanego w bakteryjnym sztucznym chromosomie (BAC). (A) Linearyzacja matrycy cDNA. Pełnowymiarowy BAC JEV jest cięty za pomocą XbaI i traktowany nukleazą z fasoli mung (MBN). (B) Synteza transkryptów RNA. Zlinearyzowane cDNA jest transkrybowane przez polimerazę RNA SP6 w obecności analogu czapeczki m⁷G(5')ppp(5')A. (C) Odzyskiwanie syntetycznych JEV. RNA transkrybowane in vitro jest transfekowane do komórek BHK-21 poprzez elektroporację, co generuje wysoki miano syntetycznego wirusa.

Rysunek 2. Specyficzna zakaźność syntetycznych RNA przepisanych z pełnowymiarowego BAC JEV oraz odzyskiwanie syntetycznego wirusa. Komórki BHK-21 poddano pozornej elektroporacji (Mock) lub elektroporacji transkryptami RNA pochodzącymi z każdego z dwóch niezależnych klonów pełnowymiarowego BAC JEV (Cl.1 i Cl.2). (A) Zakaźność RNA. Komórki pokryto agarozą i zabarwiono fioletem krystalicznym 4 dni po transfekcji. Zakaźność RNA określono za pomocą testów ognisk zakaźnych w celu oszacowania ilości zakaźnego RNA wprowadzonego do komórek metodą elektroporacji (panel lewy). Przedstawiono również reprezentatywne obrazy ognisk zakaźnych (panel prawy). (B) Ekspresja białek. Komórki hodowano na szkiełkach z komorami 4-dołkowymi. Ekspresję białek wirusowych w komórkach poddanych elektroporacji RNA w 20. godzinie po transfekcji (hpt) analizowano za pomocą testów immunofluorescencji z użyciem pierwszorzędowego króliczego przeciwciała przeciwko białku niestrukturalnemu 1 (NS1) oraz drugorzędowego koziego przeciwciała przeciwko króliczej immunoglobulinie G (IgG) koniugowanego z Cy3 (kolor czerwony). Jądra komórkowe zabarwiono kontrastowo 4',6-diamidino-2-fenyloindolem (kolor niebieski). Obrazy immunofluorescencyjne nałożono na odpowiadające im obrazy z kontrastowego mikroskopu interferencyjnego. (C) Uzysk wirusa. Komórki hodowano w szalkach hodowlanych o średnicy 150 mm. Produkcję zakaźnych wirionów nagromadzonych w supernatantach hodowlanych komórek poddanych elektroporacji RNA w 22. i 40. godzinie po transfekcji (hpt) badano za pomocą testów plackowych.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Alpha Minimal Essential Medium	Life Technologies (Gibco)	12561-049
Agaroza	Lonza	50004
Probówka stożkowa (50 mL)	VWR	21008-242
Fiolet krystaliczny	Sigma-Aldrich	C0775
Szalka hodowlana (150 mm)	TPP	93150
Kuweta (przerwa 2 mm)	Harvard Apparatus	450125
Płodowa surowica bydlęca	Life Technologies (Gibco)	16000-044
Formaldehyd	Sigma-Aldrich	F1635	Toksyczny i rakotwórczy
Glutamina	Life Technologies (Gibco)	25030-081
Minimal Essential Medium	Life Technologies (Gibco)	61100-061
Penicylina/streptomycyna	Life Technologies (Gibco)	15070-063
Chlorek potasu	Sigma-Aldrich	P3911
Fosforan potasu jednodstawny	Sigma-Aldrich	P9791
Płytka 6-dołkowa	TPP	92006
Chlorek sodu	Sigma-Aldrich	S3014
Fosforan sodu dwudstawny	Sigma-Aldrich	S3264
Trypsyna-EDTA (0,25%)	Life Technologies (Gibco)	25200-056
Witaminy	Sigma-Aldrich	M6895
Inkubator CO₂	Thermo Scientific	Heracell 150i
Wirówka laboratoryjna	Thermo Scientific	ST16R
Elektroporator	Harvard Apparatus	ECM 830