Wizualizacja nanocząsteczek wirusa zapalenia wątroby typu E za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej

Streszczenie

Źródło: Chen, C. C., et al. Surface Functionalization of Hepatitis E Virus Nanoparticles Using Chemical Conjugation Methods. J. Vis. Exp. (2018)

W niniejszym filmie zaprezentowano przygotowanie oraz barwienie negatywne nanocząsteczek przypominających wirusa zapalenia wątroby typu E w celu ich wizualizacji za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Metoda ta podkreśla integralność strukturalną samoorganizujących się cząsteczek składających się wyłącznie z kapsydu, potwierdzając ich jednorodność i czystość poprzez obrazowanie o wysokiej rozdzielczości.

Protokół

1. Obserwacja nanocząsteczek wirusa zapalenia wątroby typu E (HEVNPs) przy użyciu transmisyjnego mikroskopu elektronowego (TEM)
   1. Przygotować lub rozcieńczyć próbki HEVNP do stężenia 0,5 - 2 mg/mL w 10 mM kwasie 2-(N-morfolino)etanosulfonowym (MES) o pH 6,2 w celu obrazowania TEM.
   2. Zjonizować siatki powlekane węglem za pomocą wyładowań żarowych o natężeniu 40 mA przez 30 s, aby uzyskać hydrofilową powierzchnię węglową. Urządzenie do wyładowań żarowych opisano w Tabeli Materiałów.
      UWAGA: Hydrofilowa powierzchnia węglowa siatek zachowuje swoje właściwości jedynie przez 30 min po zabiegu wyładowań żarowych.
   3. Trzymając siatkę pęsetą, nanieść 2 µL próbki HEVNP, odczekać 15 - 30 s, a następnie osuszyć papierem filtracyjnym.
   4. Niezwłocznie przemyć siatkę wodą ddH₂0 i osuszyć papierem filtracyjnym.
   5. Niezwłocznie nanieść 2 µL 2% octanu uranylu na siatkę, odczekać 15 s, a następnie osuszyć papierem filtracyjnym. Osuszyć siatki z próbkami, umieszczając je na noc w elektronicznej szafce osuszającej.
   6. Przenieść siatkę do TEM i wykonać obrazowanie przy powiększeniu 10-80k. HEVNPs w TEM widoczne są jako puste białka dwudziścienne o średnicy ~27 nm, co wynika z braku wirusowego RNA.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
MES Hydrat	Sigma-Aldrich Chemical Co	M8250-250G	MES
EMS Glow Discharger	Electron Microscopy Science		urządzenie do wyładowań żarowych